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曲線之外:重測不是補一個漂亮數字

當未知樣品超過標準曲線線性範圍,從未反應樣品重新稀釋、反應與讀取,而不是把直線延長。

作者
CY
發表
蛋白定量:從讀值到報告 · 第 5/6 篇

最危險的結果,往往不是空白或報錯,而是一個格式完整、位數漂亮、其實來自外插(extrapolation)的數字。標準曲線(standard curve)只支持它被標準品(standard)包住的範圍;線被畫到更右邊,不代表右邊突然多出證據。

先判斷是外插還是內插

未知樣品的讀值要和本次擬合(fitting)所用的標準範圍比較。若落在最低與最高標準之間,是內插(interpolation);若超過上限或低於可用下限,不能直接報告。R² 高也不能取代範圍判讀,因為模型可能在高端彎曲時仍顯示漂亮的整體相關(correlation)。

正確的重測鏈

  1. 找回尚未加入呈色試劑(chromogenic reagent)的待測液(test sample);不要把已完成反應的孔直接加水後假裝是同一種重測(re-assay)。
  2. 依預估濃度選擇新的預稀釋倍數(predilution factor),並把這一步寫進樣品編號。
  3. 用同一批標準、同一種空白(blank)、同一種反應條件重新反應。
  4. 重新讀取,確認新 A 落在曲線支持的範圍內。
  5. 以新待測液濃度乘上原本與新增的 DF,回推原液(stock solution)。

例如,第一次讀值超出線性範圍(linear range),重新把未反應待測液再稀釋 2 倍;新測定就要把原本 DF 再乘 2。這不是把第一次的外插答案修飾一下,而是建立一筆新的、可解釋的測量鏈。

ELISA 也是同一條紀律:OD 高過最高標準品時,S 形曲線(sigmoidal curve)已經走到高原(plateau),回推出來的數字不可信,同樣要稀釋後重測,見〈讓抗體替你數蛋白:ELISA 的原理〉。

工具的角色

在濕實驗分析 › 蛋白質定量中輸入新的標準與重測讀值,工具可以協助顯示曲線、R²、孔中濃度(in-well concentration)與稀釋倍數(dilution factor)回推。工具顯示「目前輸入無法進行可靠內插」時,不是要把門檻關掉,而是回到樣品與方法紀錄,補做真正需要的測量。

「不報外插」不是保守到不能工作,而是把一次不支持的數字,轉成下一次可驗證的操作。

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