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實驗方法

蛋白定量之前,先確認你在量什麼

從原液、待測液到反應孔,先把蛋白質定量的三種濃度身分分清楚。

作者
CY
發表
蛋白定量:從讀值到報告 · 第 1/6 篇

一管蛋白從冰箱拿出來時,看起來只是「樣品」。進入定量流程後,它會短暫擁有三個身分:原液(stock solution)、待測液(test sample)、反應液(reaction mixture)。三者都可能在紀錄裡被叫作 sample;若不先分清楚,後面的公式會很漂亮,答案卻對錯瓶子。

儀器讀到的不是濃度

分光光度計(spectrophotometer)或微孔盤讀取器(microplate reader)直接讀到的是吸光值(absorbance, A),例如 A562 或 A595。濃度是把這個讀值放到同一批標準品(standard)建立的曲線後,才內插(interpolation)得到的結果。

因此,一個完整的標記至少要保留:

  1. 原液:從哪一管取出的樣品。
  2. 待測液:加入呈色試劑(chromogenic reagent)前,實際拿去建立曲線的樣品濃度。
  3. 反應孔(reaction well):待測液加上 BCA 或 Bradford 試劑後,儀器讀值所在的孔。
  4. 方法與波長:BCA 通常讀 562 nm;Bradford 通常讀 595 nm,實際仍以產品文件為準。
  5. 稀釋倍數(dilution factor):待測液如何由原液配出來。

為什麼加了試劑不能再亂乘一次

標準品與未知樣品必須用同一種加樣量、同一種工作試劑(working reagent)量、同一個反應條件。若標準曲線(standard curve)的橫軸定義是「加入呈色試劑前的待測液濃度」,曲線回算出的就是待測液濃度;反應孔體積增加本身不是另一個要重複乘上的稀釋倍數。

真正要乘回去的,是原液到待測液之間有紀錄的預稀釋倍數(predilution factor)。這個差別是蛋白質定量(protein quantitation)最常見、也最安靜的錯誤:計算機不會跳出警告,它只會忠實地把錯的瓶子算得很精準。

用工具先整理名字,再整理數字

可把自己的標準品與未知樣品讀值輸入 Lab Grimoire 的濕實驗分析 › 蛋白質定量。輸入前先在原始表格增加方法、波長、樣品編號、預稀釋倍數與重複孔(replicate wells)欄位;工具負責曲線與回推,不能替我們猜測某個數字是哪一瓶。

這篇的停止條件

如果不知道讀值是 BCA 還是 Bradford、標準曲線的濃度單位、或樣品是否在讀值前已經稀釋,先停在資料整理,不要急著內插。缺少身分欄位時,最專業的結果不是補一個答案,而是把資料缺口寫出來。

本文的流程說明不等於某一班的實測紀錄;實際試劑、儀器與體積以當批產品文件和現場程序為準。

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