標準曲線（standard curve）通常回答的是：「拿去測的待測液（test sample）有多濃？」研究者真正想知道的，常是：「原來那一管有多濃？」兩個問題之間隔著稀釋紀錄，而不是隔著一個可以憑感覺補上的倍率。
稀釋倍數的定義
每一步預稀釋（predilution）的稀釋倍數（dilution factor, DF）是：
DF = 最終體積 ÷ 取出的樣品體積
例如取 25 µL 原液（stock solution），補樣品稀釋液（sample diluent）到 250 µL，這一步是 10 倍，不是 9 倍；225 µL 是加入的稀釋液，不是 DF 的分子。若之後再做 2 倍稀釋，總 DF 是 10 × 2 = 20，不是 12。
一個教學示例
假設工具由標準曲線內插（interpolation）出待測液濃度 0.70 mg/mL，而原液先被 10 倍稀釋，再被 2 倍稀釋：
DF_total = 10 × 2 = 20
c_original = 0.70 mg/mL × 20 = 14.0 mg/mL
這組數字是教學示例，不是任何班級的原始讀值。關鍵是先確認 0.70 mg/mL 指的是哪一瓶，再把每一步有紀錄的 DF 相乘。
呈色試劑不是第二次預稀釋
如果標準曲線橫軸使用「加試劑前的標準品濃度」，未知樣品由同一條曲線回算出的也是加試劑前待測液濃度。反應孔（reaction well）裡的總體積會影響反應條件與讀值，但不能在曲線回算後再把 BCA 或 Bradford 的加樣比例乘一次。那會把同一個體積效果算兩遍。
把原始讀值與 DF 輸入濕實驗分析 › 蛋白質定量，看工具回報的孔中濃度（in-well concentration）與回推（back-calculation）原樣本濃度是否和手算一致。若不一致，先查單位、取樣體積、最終體積（final volume）與小數點，不要先改公式。
回推只能恢復已知的預稀釋；它不能讓超出標準曲線的讀值變成有效內插。