IMMUNOASSAY · 原理篇
讓抗體替你數蛋白
一管樣本裡有上千種蛋白質。Bradford 能告訴你「總共有多少」，卻說不出其中某一種有多少。這一篇要講的 ELISA，就是借用抗體的眼睛，把某一種蛋白變成一個讀得出來的數字。
往下捲動，圖會跟著你一步步組起來
同一管蛋白，三種問法
| 問題 | 方法 | 你得到 |
|---|---|---|
| 總共有多少蛋白？ | Bradford | 一個總量 |
| 其中「某一種」有多少？ | ELISA | 一個特定目標的量 |
| 它有多大？真的是它嗎？ | SDS-PAGE ＋ Western blot | 一條帶的位置與有無 |
- Bradford
- ELISA 本篇
- SDS-PAGE ＋ Western blot
三種方法回答的是不同問題，彼此不能互相取代。
CHAPTER 1 · ANTIGEN & ANTIBODY
①抗體認的是「形狀」
蛋白質表面有形狀。一條胺基酸鏈摺疊之後，表面會露出凹凸與帶電的區塊，像一顆表面有花紋的石頭。
抗體是一種專門認形狀的蛋白。它長得像英文字母 Y，兩隻手臂的末端就是辨識位。
它只扣住其中一小塊。抗體真正咬住的那一小面，叫做表位（epitope）。扣得剛好，才結合得牢。
長得像的，也可能被認錯。若另一個蛋白剛好有一塊相似的補丁，抗體也可能扣上去，這叫交叉反應。實驗背景偏高、出現假陽性，常常就是認錯了，或者沒洗乾淨。
三個名詞
- 抗原 Antigen（Ag）：被找的目標，常常是某一種蛋白。
- 抗體 Antibody（Ab）：去找目標的蛋白，Y 形。
- 表位 Epitope：抗體真正扣住的那一小塊。
比喻：抗原是一整隻羊，表位是羊毛上的一個捲。
專一性＝這支抗體認誰、不認誰。這是全篇最重要的一個詞。每次讀到訊號，先問自己：這個訊號真的來自我的目標嗎？
多株與單株
- 多株抗體（polyclonal, pAb）：一群不同的抗體，各自認同一個抗原上的不同表位。
- 單株抗體（monoclonal, mAb）：全部是同一種抗體，只認同一個表位，而且能大量、穩定地生產。
1975 年 Köhler 與 Milstein 用融合瘤技術做出單株抗體，1984 年獲諾貝爾獎。
CHAPTER 2 · WHAT ELISA MEANS
②ELISA，把「認到了」變成顏色
- Enzyme-Linked：連著酶
- Immuno：免疫，也就是抗體與抗原的辨識
- Sorbent：吸附在固體表面上，通常是 96 孔盤的孔底
- Assay：分析
抗體負責「認」，酶負責把「認到了」放大成看得見的顏色。
和 Bradford 差在哪？
Bradford 看總量。染劑會和幾乎所有蛋白結合，所以整杯牛奶裡的蛋白一起變色，量到的是總蛋白。
ELISA 看某一種。抗體只認一種形狀，所以只有目標蛋白發出訊號，其他蛋白再多也不算。
從放射性到酶
- 1960 放射免疫分析（RIA）：Yalow 與 Berson 用放射性同位素標記，非常靈敏，但同位素的管理與廢棄成本很高。Yalow 於 1977 年獲諾貝爾獎。
- 1971 ELISA 誕生：瑞典的 Engvall 與 Perlmann、荷蘭的 van Weemen 與 Schuurs 同年各自發表，改用酶來產生訊號。
- 1975 單株抗體問世，讓「同一支抗體」可以穩定供應。
- 今天 預包被套組、化學發光、一次量多個目標的平台，研究、品管與臨床檢驗都在用。
換成酶的理由是安全、便宜、容易普及。年份不用背，要記的是「為什麼換」。
CHAPTER 3 · SANDWICH ELISA
③夾心法，一步一步
夾心法（Sandwich ELISA）是最常見的格式。下面是 96 孔盤其中一個孔的剖面，往下捲，一步步把它組起來。
0.000
OD₄₅₀
- 空孔
- 包被
- 封阻
- 加樣本
- 洗
- 偵測抗體
- 受質
- 讀值
空孔
一個空的孔。孔底是塑膠，蛋白質很容易黏在上面。這個特性等一下會被利用，也會帶來麻煩。
包被（Coat）：放上捕捉抗體。捕捉抗體（capture antibody）黏在孔底，手臂朝上，像一排鉤子。
封阻（Block）：把空位蓋住。孔底還有空著的塑膠，用無關的蛋白（例如 BSA）把它蓋滿。少了這一步，什麼東西都可能黏上來，背景就會偏高。
加入樣本：目標被鉤住。樣本裡的蛋白五花八門，只有目標蛋白會被捕捉抗體扣住，其他蛋白只是漂在液體裡。
洗（Wash）：沒綁上的全部沖走。洗盤是專一性的保母。洗得不夠，殘留的蛋白會在最後一起出訊號。
加入偵測抗體：從另一側再認一次。偵測抗體（detection antibody）扣住目標蛋白的另一個表位，身上帶著酶（常用 HRP）。兩支抗體把目標夾在中間，所以叫夾心。加完再洗一次。
加入受質：酶把它變成顏色。受質（substrate，常用 TMB）原本無色，被 HRP 催化後變成藍色。目標越多，夾住的酶越多，藍色就越深。
終止與讀值：變黃，然後變成一個數字。加入酸性終止液後反應停止，藍色轉為黃色。讀盤機在 450 nm 量吸光值，你得到的是 OD₄₅₀。
所有格式共用的骨架
1 固定 → 2 結合 → 3 接上酶 → 4 產生訊號
每一步之間都要洗。下一章的四種格式，都是這四步的變化。
- 固定
- 結合
- 接上酶
- 產生訊號
CHAPTER 4 · FORMATS
④四種格式，同一個邏輯
Direct 直接法：目標固定在孔底，帶酶的一抗直接認它。步驟最少，但每一種目標都需要自己的帶酶抗體。
Indirect 間接法：一抗不帶酶，再用帶酶的二抗去認一抗。二抗可以通用，訊號也被放大。
Sandwich 夾心法：捕捉抗體與偵測抗體認不同表位，把目標夾住。專一性高，套組最常見。
Competitive 競爭法：樣本裡的目標和帶標記的目標搶有限的座位。樣本裡目標越多，標記搶到的越少，訊號就越低。
二抗，是「認抗體的抗體」
一抗專門認目標，本身可以不帶酶。
二抗認的是「某個物種的抗體」，例如抗兔抗體，而且帶著酶。
一支一抗身上可以掛好幾支二抗，所以訊號被放大。Western blot 用的也是同一套邏輯。
訊號往哪個方向走？
夾心法／間接法 0.08
競爭法 0.92
夾心法裡，目標越多訊號越強；競爭法剛好相反。說明書如果寫「訊號越低，濃度越高」，先想到競爭法。
CHAPTER 5 · STANDARD CURVE
⑤從顏色回推濃度
讀盤機只給你吸光值，不會直接告訴你濃度。和 Bradford 一樣，要靠一組已知濃度的標準品畫出標準曲線，再把未知樣本回推回去。
先畫標準品。一組已知濃度的標準品，各自讀出 OD，點在圖上。
ELISA 的曲線常常是 S 形。濃度太低時訊號貼著底，太高時抗體被占滿、訊號不再上升。套組多用四參數邏輯斯（4PL）擬合；只有中段比較接近直線。
未知樣本從 y 軸回推。讀到的 OD 畫一條水平線碰到曲線，再往下對到濃度。
超出範圍就稀釋重測，不外插。如果 OD 比最高的標準品還高，曲線已經變平，回推出來的數字不可信。正確做法是把樣本稀釋後重測，再乘回稀釋倍數。
紀律和 Bradford 相同：做複孔、扣空白、只在標準品範圍內回推、不外插、檢查曲線擬合品質。
技術怎麼變得更友善
| 面向 | 早期 | 現在常見 |
|---|---|---|
| 孔上的抗體 | 自己包被 | 預包被套組 |
| 訊號 | 呈色為主 | 呈色、螢光、化學發光 |
| 洗與加樣 | 全部手動 | 洗盤機與自動化 |
| 一次能量 | 一個目標 | 同時量多個目標 |
聽過就好的關鍵詞：
- CLIA 化學發光免疫分析：用發光取代顏色，可量的範圍更寬。
- Multiplex 多重檢測：用不同編碼的微珠，一次量好幾個目標。
- 數位／超敏 ELISA：把反應分隔到極小的空間裡逐一計數，往極低濃度推進。
- 側流快篩：家用快篩試紙是同一家族的親戚，原理相近，但不是本篇主軸。
自我檢核（先想，再點開）
Bradford 和 ELISA 各自量的是什麼？
答：Bradford 量總蛋白濃度；ELISA 量某一種特定目標的量或有無。
夾心法的四個主要步驟是什麼？
答：捕捉抗體包被 → 加入樣本 → 加入偵測抗體 → 酶與受質產生訊號並讀值。每一步之間都要洗。
為什麼競爭法的訊號會隨濃度下降？
答：樣本裡的目標和帶標記的目標搶有限的結合位，目標越多，標記結合得越少，訊號就越低。
帶走這三句
- 抗體認的是形狀；它扣住的那一小塊叫表位。
- ELISA 量的不是總蛋白，而是某一種特定目標。
- 夾心法：捕捉 → 樣本 → 偵測 → 訊號，每一步之間都要洗。