SDS-PAGE · WESTERN BLOT · 原理與操作篇
先讓蛋白排隊，再請抗體點名
ELISA 能告訴你某一種蛋白有多少，卻說不出它有多大、是不是完整的那一個。SDS-PAGE 先把一管樣本裡的蛋白依大小排成一列；Western blot 再把這一列搬到膜上，讓抗體只把目標標出來，最後交給影像系統（imaging system）與電腦，把亮度變成數字。
往下捲動，凝膠、膜與抗體會跟著你一步步組起來
同一管蛋白，三種問法
| 問題 | 方法 | 你得到 |
|---|---|---|
| 總共有多少蛋白？ | Bradford | 一個總量 |
| 其中「某一種」有多少？ | ELISA | 一個特定目標的量 |
| 它有多大？真的是它嗎？量有沒有變？ | SDS-PAGE ＋ Western blot | 一條帶（band）的位置、有無與相對強度（relative intensity） |
- Bradford
- ELISA
- SDS-PAGE ＋ Western blot 本篇
一條路線，七個站
整個流程像一條生產線，前一站的品質決定下一站還有沒有東西可看。通常會分成兩到三天完成；最常見的斷點是一級抗體（primary antibody）放 4 °C 過夜。
它是怎麼來的
- 1964Ornstein 與 Davis 提出濃縮膠（stacking gel）＋分離膠（resolving gel）的「不連續」電泳（electrophoresis），先把樣品壓成薄層再分離，帶變得又細又銳利。
- 1969Weber 與 Osborn 證明：在 SDS 膠上，移動距離與分子量（molecular weight）的對數（logarithm）幾乎成直線。從此可以用膠「量」蛋白的大小。
- 1970Laemmli 把這套不連續系統和 SDS 結合起來，成為今天最常用的 SDS-PAGE 配方。
- 1979Towbin 等人用電流把蛋白從膠上轉到硝化纖維膜（nitrocellulose membrane, NC），再用抗體偵測。
- 1981Burnette 把它命名為「Western blotting」，接續 DNA 的 Southern blot、RNA 的 Northern blot。
- 今天酶催化的化學發光（chemiluminescence）取代放射性標記（radioactive labeling），冷卻相機（cooled camera）多半取代了 X 光底片（X-ray film），影像可以直接拿去定量（quantification）。
Southern 是發明者的姓氏；Northern、Western 則是後人借題發揮的方位玩笑。年份不用背，要記的是每一步解決了什麼問題。
CHAPTER 1 · SAMPLE PREPARATION
①讓每個蛋白都變成一條直線
蛋白原本摺成各種形狀，表面的電荷也各不相同。如果直接放進膠裡，跑得快或慢會同時受形狀、電荷與大小影響，就沒辦法從位置推回大小。樣品製備（sample preparation）的目的，就是把形狀與電荷這兩個變數拿掉，只留下長度。
摺疊程度
負電覆蓋
一個摺好的蛋白。胺基酸鏈摺成立體結構，有些地方還用雙硫鍵（disulfide bond, S–S）扣在一起。表面的電荷有正有負，每一種蛋白都不一樣。
SDS 把它攤開，並且蓋滿負電。SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfate）是一種清潔劑（detergent），每 1 公克蛋白大約結合 1.4 公克 SDS。原本的電荷被大量負電蓋過，每個蛋白的「電荷對質量」比例變得幾乎一樣。
還原劑（reducing agent）剪斷雙硫鍵。SDS 解不開共價的雙硫鍵，要靠 β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol, β-ME）或 DTT 把 S–S 還原。被雙硫鍵綁在一起的次單元（subunit），這時也會分開。
加熱，讓它完全攤直。95 °C 加熱約 5 分鐘，每個蛋白都變成一條帶負電的直線。線越長，在膠裡越難前進：位置主要由大小決定。
上樣緩衝液裡有什麼
| 成分 | 作用 |
|---|---|
| SDS | 變性，並把蛋白包上負電 |
| 還原劑（β-ME 或 DTT） | 剪斷雙硫鍵 |
| 甘油（glycerol） | 讓樣品比緩衝液重，打進孔裡會沉到底 |
| 溴酚藍（bromophenol blue） | 藍色追蹤染料（tracking dye），標出電泳的最前緣 |
| Tris-HCl，pH 6.8 | 與濃縮膠相同的 pH，維持濃縮效果 |
每孔要放多少：從濃度回推體積
上樣量用前面 Bradford 量到的濃度回推。細胞或組織萃取液（lysate）常用每孔 10–40 µg 總蛋白（total protein）；純化蛋白（purified protein）只需要奈克到微克等級。記住換算：1 mg/mL ＝ 1 µg/µL。
操作重點
- 加熱後短暫離心，把管壁上的水珠與沉澱甩到管底。
- 處理好的樣品放冰上；避免反覆冷凍解凍。
- 膜蛋白（membrane protein）或容易聚集的蛋白，有時改用 37–70 °C 加熱，依說明書或文獻決定。
- 上樣順序先寫在紙上，每一管標清楚再動手。
安全：β-巰基乙醇有毒、氣味很重。開瓶與配製在化學排煙櫃（chemical fume hood）內進行；加熱時蓋緊管蓋，打開前先離心、冷卻，避免蒸氣與液滴噴出。
SDS 會讓蛋白失去活性，也會拆散蛋白複合體（protein complex）。想保留活性或原本的組合，要改用非變性電泳（Native-PAGE），不在本篇範圍。
CHAPTER 2 · CASTING THE GEL
②鑄一塊會篩分子的膠
聚丙烯醯胺膠（polyacrylamide gel）是一張立體的網。網眼大小由丙烯醯胺（acrylamide）濃度決定：濃度越高、網眼越密，小蛋白分得越開；濃度越低，大蛋白才擠得過去。這張網要在兩片玻璃之間現做。
靜置聚合，約 20–30 分鐘
組好玻璃板，先試漏。兩片玻璃中間夾著間隔條（spacer），常見厚度 0.75 或 1.0 mm。先倒水進去，確定底部不漏，再把水倒乾、用濾紙（filter paper）吸乾。
加入 APS 與 TEMED，倒分離膠。丙烯醯胺不會自己凝固：APS 產生自由基（free radical），TEMED 加速反應，兩者一加入就開始計時。輕輕混勻，倒到距離梳齒下緣約 1 cm 的高度。
上面蓋一層水或異丙醇（isopropanol）。氧氣會抑制聚合（polymerization），覆蓋液隔絕空氣，也讓膠面變平。靜置 20–30 分鐘，看到一條清楚的分界線，就是凝固了。
倒掉覆蓋液，倒濃縮膠。濃縮膠濃度低（約 4%）、pH 6.8，網眼很大。它不負責分離，只負責把樣品擠成一條細線。
插入梳子（comb）。從一側斜斜地插進去，避免梳齒下方卡住氣泡。再靜置 20–30 分鐘。
垂直拔出梳子，得到上樣孔（loading well）。慢慢往上拔，再用跑膠緩衝液（running buffer）沖一下每個孔，把殘留的碎膠沖掉，孔壁才會直。
膠的濃度怎麼選
先看目標蛋白的分子量，讓它落在膠的有效分離範圍中段。下面是同一組 marker 和一個 55 kDa 的目標，跑在四種濃度的膠裡。
膠越密，網眼越小：小蛋白被拉開，大蛋白擠在頂端。55 kDa 在 7.5% 膠裡落在中段，前後的 marker 分得最開；換成 15% 就擠到頂上，換成 5% 則快跑到底。
範圍依配方與分子量標記（molecular weight marker）而略有不同。需要一次看很寬的範圍，可以用 4–20% 的梯度預鑄膠（gradient precast gel）。
濃縮膠為什麼能把樣品擠成一條線
關鍵在 pH 與兩種跑得不一樣快的離子。在 pH 6.8 的濃縮膠裡，跑膠緩衝液中的甘胺酸（glycine）幾乎不帶淨電荷（net charge），走得很慢；氯離子（chloride ion）帶負電，走得很快。蛋白的速度介於兩者之間，被一前一後夾住，壓成一條極薄的帶。這套作法由 Ornstein 與 Davis 在 1964 年提出。
濃縮膠 · pH 6.8
分離膠 · pH 8.8
進入 pH 8.8 的分離膠後，甘胺酸有較高比例轉成帶負電，速度變快，超到蛋白前面。蛋白失去前後夾擊，網眼又變小，這時才真正依大小分開。Laemmli 在 1970 年把這套「不連續緩衝系統（discontinuous buffer system）」和 SDS 結合，就是今天的 SDS-PAGE。
安全：未聚合的丙烯醯胺是神經毒素（neurotoxin），可經皮膚吸收。優先使用預配好的溶液；若要秤粉末，在排煙櫃內進行。全程戴手套與護目鏡，手套沾到立刻更換。凝固後的膠仍可能殘留少量單體（monomer），拿取時一樣戴手套。剩下的單體溶液先讓它聚合，再依實驗室規定丟棄。TEMED 有刺鼻氣味，取用後立刻蓋回瓶蓋。
操作重點
- APS 溶液最好當天配，或分裝冷凍；放太久，膠會凝得很慢甚至不凝。
- 加完 APS 與 TEMED 輕輕旋轉混勻，不要劇烈搖晃，會打進氧氣與氣泡。
- 在管子裡留一點剩膠，看它凝了沒，就知道板子裡的膠凝了沒。
- 鑄好的膠用濕紙巾包起來、放進封口袋，4 °C 可保存一到兩天。
CHAPTER 3 · ELECTROPHORESIS
③電泳：讓蛋白依大小賽跑
每個蛋白都帶著差不多比例的負電，電場一開，大家都往正極跑。膠的網負責「擋」：分子越大，被擋得越多、跑得越慢。
電壓0V
時間0min
虛線＝實際上看不見的蛋白
裝槽、上樣。上下槽倒滿跑膠緩衝液（Tris–甘胺酸–SDS）。第一孔放分子量標記（marker），其餘依記錄的順序上樣。吸頭伸進孔裡但不要戳破孔底，慢慢打出去，樣品會因為甘油沉到底部。
接電：黑接黑、紅接紅。蛋白帶負電，往紅色的正極移動。先用約 80 V 讓樣品進膠；電極上冒出細小氣泡，代表電流有通。
在濃縮膠裡壓成一條線。不管原本的體積多大，所有蛋白都被擠成一條細帶，一起追到濃縮膠與分離膠的交界。
進入分離膠，開始依大小分開。電壓提高到約 120–150 V。小蛋白鑽得快，大蛋白被網擋住。實際操作時，你只看得到彩色的 marker 和藍色的染料前緣（dye front）；蛋白本身要染色或轉印（transfer）後才看得到，圖中的虛線是畫給你看的。
染料前緣接近膠底就關電源。藍線離膠底約 0.5 cm 時停止。跑過頭，最小的蛋白會跟著染料一起跑出膠外。
從位置回推分子量
量每條 marker 帶走了多遠。移動距離除以染料前緣的距離，得到相對移動率（relative mobility, Rf），數值介於 0 到 1。
分子量取對數，對 Rf 作圖。落在這塊膠有效範圍裡的 marker 幾乎排成直線（10% 膠約 15–75 kDa），範圍外的點會偏離。這條線就是這塊膠的「尺」。
未知帶從直線回推。量出未知帶的 Rf，對到直線上，再讀出分子量。只用這塊膠有效範圍內的 marker 畫線、不外插，和標準曲線是同一個紀律。回推值是近似值：醣化蛋白（glycoprotein）、膜蛋白或特別帶電的蛋白，常會跑得不照比例。
跑完之後的兩條路
看全部蛋白
Coomassie 染色
整塊膠泡染劑，所有蛋白都顯出藍色的帶。適合確認純度、上樣是否均勻，但分不出哪一條是你的目標。
只看目標蛋白
轉印 → Western blot
把帶搬到膜上，再用抗體只標出目標。可以回答「它在不在、多大、量有沒有變」。接下來四章走這條路。
操作重點
- 沒用到的孔也打入等體積的 1× 上樣緩衝液（loading buffer），兩側的帶比較不會歪。
- 電流太大會發熱，帶會彎成「微笑」形；室溫高時可降電壓，或在槽外放冰盒。
- 上槽緩衝液要蓋過上樣孔，跑的過程中不能漏液。
- marker 放在固定的位置（例如最左邊），轉印後才認得出方向。
- 通電中不要碰電極、導線與緩衝液；要開蓋、調整或取膠，一律先關電源、再拔導線。
CHAPTER 4 · TRANSFER
④轉印：把帶原封不動搬到膜上
膠又軟又容易破，抗體也鑽不進去。轉印用第二次電流，把膠上的蛋白往側面「搬」到一張膜上，位置完全不變。這一步像在做三明治（sandwich），順序一錯，蛋白就會跑進緩衝液裡。
先準備膜。PVDF 膜先泡甲醇（methanol）幾秒鐘活化，再泡轉印緩衝液（transfer buffer）；硝化纖維膜（NC）直接泡緩衝液。從這一刻起，膜全程都不能乾掉。在膜的一角剪一個小缺口，或用鉛筆標記方向。
黑色那面在下：海綿、濾紙。夾子（cassette）攤開，黑色面（負極側）朝下，依序放上泡濕的海綿（sponge）與濾紙。
放上膠。把膠從玻璃板上取下，切掉濃縮膠，輕輕放在濾紙上。
蓋上膜，趕走氣泡。膜從一側慢慢放下，蓋住整塊膠，再用滾筒（roller）或離心管輕輕滾過去。氣泡會擋住電流，那裡的蛋白轉不過去，最後變成白色圓點。
濾紙、海綿，闔上夾子。完整順序是「黑－海綿－濾紙－膠－膜－濾紙－海綿－紅」。口訣：膠靠黑、膜靠紅。
通電：蛋白從膠走到膜上。蛋白帶負電，往紅色的正極移動，於是離開膠、被膜牢牢抓住。濕式轉印（wet transfer）常用 100 V、1 小時（槽內放冰），或 30 V 在 4 °C 過夜；半乾式（semi-dry transfer）約 15–30 分鐘。
取出膜，用 Ponceau S 確認。整張膜染出粉紅色的帶，代表轉印成功，也能看出各孔上樣量是否接近。拍照記錄後，用水或 TBST 洗掉粉紅色，再進入下一步。
膜與轉印方式的選擇
| PVDF | 硝化纖維（NC） | |
|---|---|---|
| 前處理 | 先泡甲醇活化 | 直接泡緩衝液 |
| 強度 | 韌，可剝除（stripping）抗體後再偵測 | 較脆，容易破 |
| 結合力 | 較高 | 中等 |
| 背景（background） | 略高 | 較低 |
| 濕式轉印 | 半乾式轉印 | |
|---|---|---|
| 緩衝液 | 整槽浸泡，可加冰 | 只浸濕濾紙 |
| 時間 | 1 小時到過夜 | 15–30 分鐘 |
| 大蛋白（> 100 kDa） | 效率較好 | 可能轉不完全 |
操作重點
- 戴手套，用鑷子夾膜的邊緣；手指碰過的地方會留下指紋狀的背景。
- 膜上的記號用鉛筆，不要用原子筆，墨水會在後面的步驟溶出。
- 甲醇易燃、有毒：活化 PVDF 與配轉印緩衝液時遠離火源，在通風處操作，廢液依規定回收。
- 轉印緩衝液常含 10–20% 甲醇，幫助蛋白結合到膜上；但甲醇越多，大蛋白越難離開膠。
- 預染 marker 會一起轉到膜上：轉印完先看膜上有沒有彩色的 marker，是最快的檢查。
CHAPTER 5 · BLOCKING & PRIMARY ANTIBODY
⑤封阻，然後請一級抗體點名
膜之所以抓得住蛋白，是因為它幾乎什麼蛋白都黏。同一個特性也會讓抗體到處亂黏，所以要先把空位蓋住，再請抗體上場。這和 ELISA 的封阻（blocking）是同一個道理。
轉印後的膜。每一種蛋白黏在自己的位置上，帶與帶之間還有大片空著的膜面，什麼都還能黏上去。
封阻：用無關的蛋白把空位蓋滿。常用 5% 脫脂奶粉（nonfat dry milk）或 3–5% BSA，溶在 TBST（含 0.1% Tween 20 的 Tris 緩衝食鹽水，Tris-buffered saline）裡，室溫搖 1 小時。
一級抗體：只認目標。依說明書稀釋（常見 1:500–1:5000），室溫 1–2 小時，或 4 °C 放在搖盪器（shaker）上過夜。它主要扣住目標蛋白的表位（epitope），旁邊的蛋白大多不理。
洗掉沒扣牢的。TBST 洗 3 次，每次 5–10 分鐘。黏得不牢的抗體被沖走；洗得不夠，最後整片背景都會亮。
內部對照（loading control）怎麼一起偵測
目標和內部對照（例如 β-actin、GAPDH，以下簡稱內控）都要從同一張膜上量。常見三種做法：
- 剪膜：兩者分子量相差夠遠時，依 marker 把膜剪成上下兩段，各自孵育不同的一級抗體。
- 剝除後再偵測：先偵測目標，用剝除液（stripping buffer）洗掉抗體，再偵測內控。PVDF 比較耐得住這個步驟。
- 不同物種＋螢光：兩支一級抗體來自不同宿主，配上不同顏色的螢光二級抗體（fluorescent secondary antibody），一次拍兩個通道。
一級抗體怎麼看說明書
- 宿主物種（host species）：兔、小鼠、山羊……決定下一步要用哪一種二級抗體（secondary antibody）。
- 驗證過的應用：要標明 WB。只驗證過 ELISA 或染色的抗體，不一定認得變性後的蛋白。
- 預期分子量：拿來和你回推出來的帶對照。
- 建議稀釋倍數：第一次照建議做，再依背景與訊號調整。
操作重點
- 偵測磷酸化蛋白（phosphoprotein）時多用 BSA 封阻：奶粉裡的酪蛋白（casein）本身就是磷酸化蛋白，會讓背景升高。
- 抗體很貴：把膜放進剛好大小的盒子或袋子，液體能完整蓋過膜就夠。
- 膜要整片浸在液體裡、放在搖盪器上；乾掉的地方會留下斑塊。
- 一抗（primary antibody）稀釋液加入疊氮化鈉（sodium azide, NaN₃）後可冷藏重複使用；但疊氮化鈉會抑制 HRP，絕不能加進二抗（secondary antibody）或呈色（detection）步驟。疊氮化鈉本身劇毒，也會和金屬水管形成易爆的疊氮化物（azide），不可倒入水槽，依實驗室規定回收。
CHAPTER 6 · SECONDARY ANTIBODY & DETECTION
⑥二級抗體，把「在這裡」變成光
一級抗體本身看不見。二級抗體認的是「一級抗體的物種」，身上帶著酶（常用 HRP），負責把「抗體在這裡」變成光或顏色。
二級抗體：認一級抗體的物種。一抗是兔子做的，就用抗兔 IgG 的二抗，例如山羊抗兔 IgG–HRP。常見稀釋 1:2000–1:20000，室溫 1 小時，之後一樣用 TBST 洗 3 次。
一支一抗可以掛好幾支二抗。每多掛一支，就多一個酶，訊號因此被放大。代價是：二抗用錯物種，整條路就斷了。
化學發光（ECL）：酶讓受質發光。把 A、B 兩液等量混合，均勻蓋滿膜 1–5 分鐘。HRP 催化 luminol 氧化並放出微弱的光，光只出現在有抗體的位置，要用影像系統或 X 光底片記錄。
呈色法（TMB 或 DAB）：直接長出顏色。改用沉澱型受質（precipitating substrate），帶的位置會長出藍色（TMB）或棕色（DAB），用肉眼就看得到。不需要儀器，但靈敏度（sensitivity）較低；顏色會一路累積、沒有可停在中途的讀值，強帶很容易就深到飽和（saturation）。
| 化學發光（ECL） | 呈色（TMB／DAB） | |
|---|---|---|
| 看到什麼 | 光，需要影像系統或底片 | 顏色，肉眼可見 |
| 靈敏度 | 高 | 中到低 |
| 適合定量 | 數位影像的線性範圍（linear range）較寬 | 範圍窄，容易飽和 |
| 訊號保存 | 依受質而異，數分鐘到數小時內逐漸變弱 | 顏色留在膜上，但會慢慢褪 |
機器操作：化學發光影像系統
各家儀器的介面不同，原則都一樣：讓相機在黑暗中收集膜上發出的微光，曝光（exposure）時間決定影像有多亮。
模式待機
曝光—
飽和像素0
開機，讓相機降溫。冷卻式 CCD 相機（cooled CCD camera）要先降到工作溫度，雜訊才會低。趁這幾分鐘配 ECL 受質。
放膜：蛋白面朝上，放在托盤中央。多餘的 ECL 液瀝掉，蓋一張透明膜或放進透明袋，把氣泡趕出去，關上門。
先拍一張白光影像（white-light image），留下 marker。預染 marker 不會發光，在化學發光影像裡看不見。這張白光影像之後要疊回去，才對得出分子量。
切到化學發光模式，從短曝光開始。光很弱，曝光越久、帶越亮。可以設定一連串遞增的曝光時間，讓儀器自動連拍。
曝光太久，就會飽和。亮度超過相機能記錄的上限，最亮的帶被截平，軟體通常用紅色標出這些像素（pixel）。飽和的帶看起來很漂亮，但已經不能拿來定量；注意內控也會飽和。
選最長、但沒有飽和的那一張，存原始檔（raw file）。存成 16-bit TIFF 或儀器的原始格式。不要先調亮度或對比再拿去定量；做簡報用的圖另外匯出。
操作重點
- ECL 的光會隨時間變弱：加完受質後盡快拍，同一張膜的曝光系列要連續拍完。
- 托盤與膜之間的液體要瀝乾，殘留的水痕會在影像上變成亮斑。
- 用完擦乾托盤；ECL 與膜依實驗室規定處理。
- 沒有影像系統時，可用 X 光底片在暗房（darkroom）曝光，但底片的線性範圍窄，定量要更保守。
CHAPTER 7 · DENSITOMETRY
⑦電腦判讀：把帶變成數字
一條帶有多深，可以換成一個數字：把那個範圍裡每個像素的亮度加總，扣掉背景，就是這條帶的積分強度（integrated intensity）。常用免費的 ImageJ（Fiji），或直接在瀏覽器裡完成。
打開原始影像。用 16-bit TIFF，不用截圖或 JPEG。化學發光影像有時是黑底白帶、有時是白底黑帶；量之前先統一方向：ImageJ 的 Gels 工具預設處理白底黑帶，黑底白帶的影像要先用 Edit › Invert 反轉。
框出每一條泳道（lane）。用同樣大小的長方形框住每一孔的目標帶。ImageJ：Analyze › Gels › Select First Lane，再 Select Next Lane。
畫出強度剖面（intensity profile）。每一條泳道變成一條曲線，帶就是一座山峰（Plot Lanes）。山越高、越寬，帶就越強。
封口，量面積。用直線把每座山的山腳連起來，扣掉下面的背景，再量山峰的面積。每一條泳道的封口方式要一致。
除以內控。同一孔的 β-actin（或 GAPDH）也量一次。目標面積除以內控面積，修正每一孔上樣量的小差異。
換成相對於對照組（control group）的倍數。對照組設為 1.00，其他組都除以對照組的比值。這才是可以比較、可以拿去做統計的數字。
| 泳道 | 目標面積 | β-actin 面積 | 目標 ÷ β-actin | 相對倍數（fold change） |
|---|---|---|---|---|
| 對照 | 12,400 | 20,100 | 0.617 | 1.00 |
| 處理 A | 18,900 | 19,600 | 0.964 | 1.56 |
| 處理 B | 6,300 | 20,800 | 0.303 | 0.49 |
表中數字是示意用的單次量測。真正的結論要來自至少三次獨立實驗（independent experiments）。
拿自己的影像量一次：Western Blot 條帶定量工具 →
讓數字站得住的五條紀律
- 只量線性範圍裡的帶。飽和的帶會被低估；太淡、貼近背景的帶誤差很大。
- 內控也要檢查。β-actin 含量很高，常常比目標先飽和；某些處理也會改變內控本身的量。可以減少上樣量，或改用總蛋白染色（total protein staining）做標準化（normalization）：stain-free 膠的線性範圍較寬，Ponceau 較窄。
- 它是半定量（semi-quantitative）。Western blot 適合比較同一張膜上的相對變化，不適合直接報告絕對濃度。
- 分清楚重複的層級。獨立培養、獨立動物或獨立處理得到的樣品，才是生物重複（biological replicate）；同一份萃取液重跑一次，或同一張膜量三次，都只是技術重複（technical replicate）。
- 保留原始檔與量測框。任何亮度調整都要套用到整張影像，並且說明清楚。
CHAPTER 8 · TROUBLESHOOTING
⑧出錯了怎麼看
每一種失敗都會在膜上留下特定的形狀。先看形狀，再沿著七個站往回推，找出是哪一站出了問題。
抗體／呈色
一條帶都沒有，只剩 marker
可能原因：轉印失敗；二抗不是針對一抗的宿主物種；抗體或 ECL 失效；HRP 被疊氮化鈉抑制。
先試試：看 Ponceau 有沒有帶；核對一抗宿主與二抗；把一滴稀釋的二抗混入 ECL，看會不會發光。
封阻／清洗
整片背景很深
可能原因：封阻不夠；抗體太濃；清洗不足；膜曾經乾掉；曝光太久。
先試試：延長封阻、提高抗體稀釋倍數、多洗一次、縮短曝光。
電泳
帶彎成微笑形
可能原因：電壓太高、膠的中間比兩側熱；緩衝液太少或配錯。
先試試：降低電壓、使用冷的緩衝液、確認液面蓋過上樣孔。
轉印
帶上有白色圓點
可能原因：組轉印三明治時，膠與膜之間夾了氣泡。
先試試：每放一層就滾一次；膜從一側慢慢放下，不要整片拍下去。
樣品製備
一整條拖尾
可能原因：上樣太多；樣品降解（degradation）；含高鹽或 DNA；變性不完全。
先試試：減少上樣量、萃取時加蛋白酶抑制劑（protease inhibitor）、加熱後離心取上清（supernatant）。
抗體
多出好幾條帶
可能原因：抗體不夠專一；蛋白降解（出現較小的帶）；修飾或複合體（較大的帶）；二抗交叉反應（cross-reactivity）。
先試試：提高稀釋倍數；做一組只加二抗的對照；查說明書的預期分子量。
抗體／呈色
帶的中間反而變白
可能原因：那裡的 HRP 太多，受質在幾秒內就被用光，中心先熄滅。
先試試：降低抗體濃度或上樣量；加完 ECL 盡快拍攝。
鑄膠／電泳
帶歪斜或呈波浪狀
可能原因：膠聚合不均；梳子拔歪或孔裡有碎膠；樣品鹽濃度太高。
先試試：鑄膠（gel casting）時把架子放水平；拔梳後沖孔；控制樣品的鹽濃度。
自我檢核（先想，再點開）
加了 SDS 之後，為什麼蛋白在膠上的位置只和大小有關？
答：SDS 讓蛋白攤直，並以大致固定的比例包上負電。形狀與原本電荷的差異被抹平，剩下的差異主要是長度，也就是分子量。少數蛋白（例如醣化蛋白、膜蛋白）仍會跑得不照比例。
轉印三明治裡，膜要放在膠的哪一側？為什麼？
答：放在靠正極（紅色）的那一側。蛋白帶負電，通電後往正極移動，離開膠時剛好被膜抓住。
Ponceau 看得到帶，但呈色後一條帶都沒有，問題比較可能出在哪幾站？
答：轉印已經成功，問題在抗體與呈色：一抗或二抗失效、二抗不是針對一抗的宿主物種、HRP 被疊氮化鈉抑制，或 ECL 受質失效。
為什麼定量要選「最長但沒有飽和」的那一張曝光？
答：飽和代表亮度已經頂到相機上限，帶的面積會被低估；曝光太短，淡的帶又貼近背景。夠亮又沒有飽和的影像，才落在線性範圍裡。
目標帶的面積為什麼要除以 β-actin？
答：修正每一孔上樣量的差異。比較的是同一孔「目標 ÷ 內控」的比值，再換算成相對於對照組的倍數。
帶走這三句
- SDS 把形狀與電荷抹平，膠上的位置主要反映大小。
- 膠靠黑、膜靠紅：蛋白帶負電，一路往正極走。
- 能定量的影像沒有飽和，並且除以內控、和對照組比。