Western blot 分析（SDS-PAGE 與 Immunoblotting）

Western blot 分析（SDS-PAGE 與 Immunoblotting）

biochemistry · 中階 · 2–3 天 (8–10 小時 active; overnight primary antibody incubation required)

https://labgrimoire.com/zh/protocols/western-blot-sds-page/

材料

• ☐ Acrylamide/Bis solution (30%, 29:1 crosslinker ratio)：視需求（⚠ 未聚合型具神經毒性；戴 nitrile gloves，並在 chemical fume hood 中操作。於 4°C 避光保存。）
• ☐ 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8：視需求（resolving gel buffer。以 ddH₂O 配製，用 HCl 調整 pH，並以 autoclave 或 filter-sterilize 處理，於 4°C 保存。）
• ☐ 1.0 M Tris-HCl, pH 6.8：視需求（stacking gel buffer。依上述方式配製並保存。）
• ☐ SDS, 10% (w/v) solution：視需求（SDS 溶於 ddH₂O。室溫保存；低於 15°C 可能析出，使用前加溫並溶解。）
• ☐ APS, 10% (w/v) ammonium persulfate：視需求（以 ddH₂O 新鮮配製，或分裝後於 −20°C 保存，最長 2 個月。於 4°C 保存 2–4 週後，活性會明顯下降。）
• ☐ TEMED (N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine)：視需求（聚合催化劑。於 4°C 保存；若顏色變深或氣味改變，請丟棄。）
• ☐ 2× or 4× Laemmli SDS sample buffer：視需求（含 SDS、glycerol、Tris-HCl pH 6.8 與 bromophenol blue。每次使用前加入新鮮 β-mercaptoethanol。）
• ☐ β-Mercaptoethanol (β-ME)：每次實驗 50–100 μL（用於還原 disulfide bond。具揮發性且氣味強烈，僅在 chemical fume hood 中加入。）
• ☐ Pre-stained protein molecular weight ladder：每個 lane 3–5 μL（選擇 MW 範圍涵蓋目標蛋白質預期大小的 molecular weight ladder。）
• ☐ Isopropanol (100%)：約 5 mL（聚合期間覆蓋 resolving gel，以隔絕氧氣。）
• ☐ Methanol (100%)：100 mL（用於 PVDF membrane 活化及 transfer buffer 配製。）
• ☐ PVDF membrane (0.45 μm pore size)：視需求（多數目標適用。蛋白質 < 20 kDa 時使用 0.22 μm pore size。）
• ☐ Nitrocellulose membrane：視需求（PVDF 的替代選擇；不需 methanol 活化。）
• ☐ Transfer buffer (1×)：1 L（含 ddH₂O 中的 25 mM Tris、192 mM Glycine 與 20% (v/v) methanol。除非轉移 high-MW protein，否則勿加入 SDS。預冷至 4°C。）
• ☐ 10× TBS (Tris-buffered saline)：視需求（含 ddH₂O 中的 200 mM Tris-HCl pH 7.6 與 1.5 M NaCl。稀釋至 1×，再加入 Tween-20 至 0.1% (v/v)，製成 TBS-T。）
• ☐ Blocking buffer — milk：10–20 mL（將 5% non-fat dry milk 溶於 TBS-T。新鮮配製；用於一般未磷酸化蛋白質目標。）
• ☐ Blocking buffer — BSA：10–20 mL（將 5% bovine serum albumin 溶於 TBS-T。新鮮配製；供 phospho-specific antibody target 使用。）
• ☐ Primary antibody (target-specific)：視需求（依製造商 datasheet，以適當的 blocking buffer 稀釋。）
• ☐ HRP-conjugated secondary antibody：視需求（物種須與 primary antibody 相符（anti-rabbit、anti-mouse 等）。）
• ☐ ECL chemiluminescence substrate：視需求（雙試劑系統（Reagent A + Reagent B）。使用前立即以 1:1 混勻。）
• ☐ Ponceau S staining solution：5 mL（含 5% (v/v) acetic acid 的 0.1% (w/v) Ponceau S。可重複使用；室溫保存。）
• ☐ 1× Running buffer (Tris-Glycine-SDS)：1 L（以 ddH₂O 配製，含 25 mM Tris、192 mM Glycine 與 0.1% SDS。）
• ☐ Stripping buffer (optional)：10–20 mL（含 62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2% (w/v) SDS 與 100 mM β-ME。使用前立即在 chemical fume hood 中配製。）

設備

• ☐ Mini SDS-PAGE apparatus (glass plates, spacers 1.0 mm, comb)（標準 mini-gel 格式（約 8 × 7 cm）。確認 glass plate 清潔且無油脂。）
• ☐ Electrophoresis power supply（設定 constant-voltage mode；可提供 80–120 V。）
• ☐ Wet transfer apparatus (transfer tank, cassette, fiber pads)（以預冷 transfer buffer 加滿；放入 magnetic stir bar 使 buffer 循環。）
• ☐ Cooling device for transfer (ice pack or recirculating cooler)（高電流轉漬期間維持 buffer於 4°C，避免 gel 膨潤與熱造成的假象。）
• ☐ Chemiluminescence CCD imaging system（可進行多次定時曝光並擷取 16-bit 影像供 densitometry；film-based detection 亦可，但定量性較低。）
• ☐ Rocking or oscillating platform (rocker)（用於所有 antibody 反應與 membrane 清洗。）
• ☐ Heating block or water bath (set to 95–100°C or 37°C)（用於 protein sample 變性。）
• ☐ Microcentrifuge（用於變性後樣品的短暫離心（10,000 × g，30 sec）。）
• ☐ Spectrophotometer or plate reader (595 nm, for Bradford assay)（用於蛋白質定量；亦可採 BCA microplate 格式。）
• ☐ Flat-tip forceps（用於操作 membrane。切勿徒手接觸 membrane。）
• ☐ Glass rod or 15 mL conical tube（組裝 transfer sandwich 時，用於滾除氣泡。）
• ☐ Filter paper (cut to gel size)（組裝前浸入 transfer buffer，用來墊在 transfer sandwich 中。）

步驟

1. ☐ 選擇 acrylamide 濃度並配製 resolving gel 溶液（10 min）

   — Part A：Gel 配製 —

   依目標蛋白質預期分子量，決定適用的 resolving gel acrylamide 濃度：

   Target MW	建議 acrylamide %
   > 100 kDa	8%
   40–100 kDa	10%
   25–60 kDa	12%
   10–30 kDa	15%

   依序將下列試劑加入 50 mL conical tube，配製 10 mL resolving gel solution（以 10% gel 為例）：

   成分	8%	10%	12%	15%
   ddH₂O	4.6 mL	4.0 mL	3.3 mL	2.3 mL
   30% Acrylamide/Bis (29:1)	2.7 mL	3.3 mL	4.0 mL	5.0 mL
   1.5 M Tris-HCl pH 8.8	2.5 mL	2.5 mL	2.5 mL	2.5 mL
   10% SDS	100 μL	100 μL	100 μL	100 μL

   以旋轉方式輕輕混勻。此時不可加入 APS 或 TEMED。

2. ☐ 鑄製 resolving gel 並使其聚合（30–45 min）

   依製造商指示組裝 gel casting apparatus。先注水確認無漏液，再進行鑄膠。 依序將下列試劑加入 resolving gel solution：

   • 10% APS：100 μL
   • TEMED：4 μL（10% gel 使用；8% 使用 6 μL，12% 與 15% 使用 4 μL） 以旋轉方式輕輕混勻（勿以 vortex 混勻，以免產生氣泡）。 立即將混合液倒入玻璃板之間，液面約低於短板頂端 1.5 cm。 輕輕覆蓋約 500 μL 的 100% isopropanol。 於室溫反應 30–45 分鐘。若在 isopropanol 層下方看到清晰、具折射感的界面，即表示完全聚合。
3. ☐ 準備 stacking gel 並鑄製於 resolving gel 上（15–20 min）

   完全丟棄 isopropanol 覆蓋液；以 filter paper 條吸乾 gel 表面的殘液。 配製 5 mL、5% stacking gel solution：

   成分	用量
   ddH₂O	3.4 mL
   30% Acrylamide/Bis (29:1)	830 μL
   1.0 M Tris-HCl pH 6.8	630 μL
   10% SDS	50 μL

   加入 50 μL 10% APS 與 5 μL TEMED，以旋轉方式輕輕混勻。 立即將 stacking gel solution 倒在 resolving gel 表面，注至玻璃板頂端。 平順插入 well comb，避免梳齒下方困住氣泡。 於室溫反應 15–20 分鐘。

4. ☐ 定量蛋白質並準備等量樣品（30 min）

   使用 Bradford 或 BCA assay 測定各樣品的蛋白質濃度。 計算每個 lane 所需的樣品體積，使各 lane 加入相同蛋白質質量。常見上樣量為每個 lane 20–40 μg 總蛋白質，並依目標蛋白質豐度調整。 將各樣品體積與 2× Laemmli sample buffer 混合（加入等體積 2× buffer），或使用 4× buffer（加入 4× buffer 體積的三分之一）。 在 chemical fume hood 中，將 β-mercaptoethanol 加入 sample buffer，使最終濃度為 5% (v/v)。 確認正規化後各 lane 的最終體積一致。

5. ☐ 使蛋白質樣品變性（5 min）

   一般可溶性蛋白質：在 heating block 中以 95–100°C 加熱 5 分鐘。 多次穿膜蛋白：以 37°C 加熱 30 分鐘，避免熱誘發不可逆聚集及high-MW 條帶拖尾。 以 10,000 × g 離心 30 秒，沉降不溶性碎屑並收取冷凝液。 上樣前將樣品置於冰上。

6. ☐ 將樣品加入 well 並進行 SDS-PAGE 電泳（80–120 min）

   將已聚合的 gel cassette 裝入 electrophoresis tank；內外槽加入 1× running buffer（25 mM Tris、192 mM Glycine、0.1% SDS）。 小心取下 well comb；以 gel-loading tip 和 running buffer 沖洗 wells，移除未聚合 acrylamide 或碎屑。 將 3–5 μL pre-stained molecular weight ladder 加入第一個 lane。 以 gel-loading tip 將蛋白質樣品加入後續 wells，tip 插至略高於 well 底部，以免產生氣泡。 以 80 V（constant voltage）電泳，直到 bromophenol blue dye front 通過 stacking gel 並進入 resolving gel（約 20–30 min）。 將電壓提高至 120 V，繼續電泳直到 bromophenol blue front 到達 resolving gel 底部（約 60–90 min）。 當 bromophenol blue front 距 gel 底緣 0.5 cm 時停止電泳。

7. ☐ 活化 PVDF membrane 並組裝轉漬夾層（10 min）

   將 PVDF membrane 與 filter paper 剪成 gel 尺寸。 PVDF membrane：浸入 100% methanol，恰好 15 秒（直到顏色由白色轉為半透明），再立即轉移至 transfer buffer 平衡 ≥5 分鐘。 Nitrocellulose membrane（替代選項）：略過 methanol 步驟，直接浸入 transfer buffer 5 分鐘。 將 1 L transfer buffer（25 mM Tris、192 mM Glycine、20% v/v methanol，以 ddH₂O 配製）預冷至 4°C。

   • 蛋白質 > 100 kDa：使用含 10% methanol + 0.05% SDS 的 transfer buffer，以提高大型蛋白質的轉移效率。 在盛有 transfer buffer 的 tray 中組裝轉漬夾層（由陰極 [黑面] 至陽極 [紅面]）：

   [Cathode / Black] → Fiber pad → Filter paper → Gel → Membrane → Filter paper → Fiber pad → [Anode / Red]
   

   以 glass rod 滾過組裝完成的夾層，排除 gel 與 membrane 間所有氣泡。

8. ☐ 進行濕式電泳轉漬（60–90 min）

   將組裝好的夾層 cassette 插入 transfer tank，確認 gel 朝向陰極（黑色接頭），membrane 朝向陽極（紅色接頭）。 以預冷 transfer buffer 完全注滿 transfer tank；加入 magnetic stir bar 使 buffer 循環。 以冰塊包圍 transfer tank，或置於 4°C 冷房。 以 100 V（constant voltage）轉漬 60–90 分鐘。

   • 蛋白質 > 150 kDa：延長至 120 分鐘，或以 30 V、4°C 隔夜轉漬。
9. ☐ 以 Ponceau S 染色確認轉漬效率（10 min）

   拆開 transfer cassette；以 forceps 取出 membrane。 將 membrane 浸入 Ponceau S staining solution（0.1% w/v，溶於 5% acetic acid），輕輕振盪反應 5 分鐘。 以 ddH₂O 潤洗，直到蛋白質條帶在白色背景上呈粉紅／紅色。 確認所有樣品 lane 均有條帶、ladder 清晰可見、沒有白色圓形空缺（氣泡假象），且分布均勻。 拍攝 Ponceau 染色後的 membrane，留存紀錄。 進入 blocking 前，以 TBS-T（3 × 5 min）清洗 membrane，完全去除染色液。

10. ☐ 封閉 membrane 以降低非專一性 antibody 結合（1 hr）

    依 antibody 標的選擇 blocking buffer：

    • 5% non-fat dry milk in TBS-T → 用於一般蛋白質標的（例如總蛋白質量、結構蛋白）。
    • 5% BSA in TBS-T → 用於磷酸化專一性 antibody（磷酸化蛋白質標的），或 datasheet 指示不可使用 milk 的 antibody。 於室溫將 blocking agent 溶於 1× TBS-T，新鮮配製 blocking buffer。 將 membrane 浸入 blocking buffer，於室溫反應 1 小時並輕輕搖晃。
11. ☐ 與 primary antibody 反應（overnight, 4°C）

    依製造商 datasheet 建議的濃度，將 primary antibody 稀釋於適當的 blocking buffer。HRP/ECL 偵測常用的起始稀釋比例為 1:500 至 1:2,000（每種 antibody 均須實際最佳化）。 將 membrane 與 primary antibody solution 一起放入密封容器（hybridization bag、小盒或可重複密封的袋子），確保 membrane 完全覆蓋且 antibody 用量最少。 於 4°C 隔夜反應（12–16 小時），並持續輕輕搖晃。

12. ☐ 清洗 membrane 以移除未結合的 primary antibody（30 min）

    倒掉 primary antibody solution。若要重複使用，可回收至乾淨 tube，並加入 0.02% sodium azide 後於 4°C 保存（依 antibody 而異，通常可重複使用 2–3 次）。 以 TBS-T 清洗 membrane 三次，每次 10 分鐘，於室溫並劇烈搖晃。 每次清洗後丟棄洗液。

13. ☐ 與 HRP-conjugated secondary antibody 反應（1 hr）

    以 1:5,000 至 1:10,000 將 HRP-conjugated secondary antibody 稀釋於 5% non-fat dry milk / TBS-T（依每批試劑／antibody 最佳化）。

    • 即使 primary antibody 使用 BSA 封閉，secondary antibody 仍使用 milk blocking buffer。 於室溫反應 1 小時，並輕輕搖晃。
14. ☐ 清洗 membrane 以移除未結合的 secondary antibody（30 min）

    以 TBS-T 清洗 membrane 三次，每次 10 分鐘，於室溫並劇烈搖晃。 最後一次清洗後，以 paper towel 輕觸 membrane 邊緣吸除多餘 buffer，但不可讓 membrane 乾燥。

15. ☐ 加入 ECL 受質並擷取化學發光影像（15 min）

    使用前立即依製造商指示，以等體積混合 Reagent A 與 Reagent B，配製 ECL substrate。只使用足以覆蓋 membrane 表面的最小體積。 將 membrane 移至乾淨平面，protein-side 朝上；將 ECL substrate 均勻滴加於整個 membrane 表面。 依製造商指定時間反應（通常為 1–5 分鐘）。 傾斜 membrane 排出多餘 substrate；不要潤洗。 將 membrane 移至 imaging system，以多種曝光時間擷取影像（例如 5 sec、15 sec、30 sec、1 min、5 min）。 選擇可得到最大未飽和訊號的最短曝光時間，供 densitometric analysis 使用。

16. ☐ 進行 densitometric quantification 與統計分析（30 min）

    使用 ImageJ (FIJI)、Image Lab 或同等 densitometry software 開啟選定的未飽和影像。 在各 lane 的每個 band 周圍定義一致的感興趣區域（ROI）；以一致方法扣除背景（rolling ball algorithm 或相鄰 lane 背景）。 測量各目標蛋白質 band 的整合 band 強度（optical density × area，任意單位）。 測量同一 lane 中loading control protein的整合 band 強度（例如 β-actin 為 42 kDa、GAPDH 為 37 kDa，或 α-tubulin 為 50 kDa）。

    • 選擇不與目標蛋白質 band 共遷移的 loading control（避免 same-MW overlap）。 依下式計算每個 lane 的正規化蛋白質表現量：

    Normalized intensity = (Target protein band intensity) ÷ (Loading control band intensity) 結果以相對於對照組的fold change表示（將對照組平均值設為 1.0）。 收集 ≥3 個獨立生物重複的數據（每次重複均為獨立準備並獨立執行的實驗；單次實驗內的技術重複不能取代生物重複）。 進行統計分析：Student's t-test（兩組比較），或one-way ANOVA 加事後檢定（三組以上）。報告平均值 ± SEM 或 SD，並列出樣本數（n）。

17. ☐ 剝除 membrane 上的 antibody，並以不同 antibody 再次偵測（50 min + 10 min wash）

    在 chemical fume hood 中配製 stripping buffer：62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2% (w/v) SDS、100 mM β-mercaptoethanol，以 ddH₂O 配製。 將 membrane 轉移至可密封容器中的 stripping buffer，於 chemical fume hood 內輕輕振盪反應 50°C、30 分鐘。 將 membrane 移至 TBS-T tray，以室溫清洗 3 × 10 分鐘，移除 stripping buffer。 短暫進行 ECL 曝光，確認先前 antibody 訊號已完全移除，再進行新一輪偵測。 返回封閉步驟（Step 10），並以新 antibody 重複免疫偵測（Steps 11–15）。