夾心式 ELISA（Sandwich ELISA）通用流程

夾心式 ELISA（Sandwich ELISA）通用流程

biochemistry · 中階 · 3–4 小時

https://labgrimoire.com/zh/protocols/sandwich-elisa-general/

材料

• ☐ ELISA Kit (pre-coated 96-well plate included)：1 kit（依各 kit 規格；本流程採用多數商用 cytokine/growth-factor kit 常見的 sandwich ELISA 格式）
• ☐ Lyophilized or liquid standard：依 kit 規格（依說明保存；以 Sample Diluent 溶解凍乾粉末；勿以 vortex 混勻）
• ☐ Biotinylated detection antibody：依 kit 規格（依 kit 說明稀釋至 working concentration（常用 1:100））
• ☐ HRP-Streptavidin concentrate：依 kit 規格（依 kit 說明稀釋至 working concentration（常用 1:40–1:100）；使用前立即配製）
• ☐ TMB Substrate Solution：依 kit 規格（避光保存；使用前溶液應為無色；若呈藍色則丟棄）
• ☐ Stop Solution (2 N H₂SO₄)：依 kit 規格（具腐蝕性；穿戴手套與護目裝備）
• ☐ Wash Buffer (10× PBS-T concentrate)：依 kit 規格（以去離子水按 1:10 稀釋，配製 1× working solution）
• ☐ Sample Diluent / Assay Buffer：依 kit 規格（用於標準品復溶、序列稀釋及樣品稀釋）
• ☐ Deionized water (ddH₂O)：適量（用於配製 Wash Buffer）
• ☐ Plate sealer film：適量（避免反應步驟期間蒸發）

設備

• ☐ Microplate spectrophotometer (ELISA reader)（須可讀取 450 nm；建議以 570 nm 或 630 nm 進行雙波長校正）
• ☐ Multichannel pipette (8-channel, 50–300 µL)（可降低 pipetting CV；用於 plate 內所有液體分注）
• ☐ Plate washer (manual or automated)（優先使用自動式；手動時使用 squirt bottle，300 µL/well/wash）
• ☐ Plate shaker / orbital rocking platform（反應期間設定為輕微搖動（約 150–200 rpm））
• ☐ 37°C incubator or water bath（供標準室溫反應使用；若室溫穩定，也可在室溫（20–25°C）桌面反應）
• ☐ Refrigerator (4°C)（供隔夜反應選項（Step 4）使用）
• ☐ Microcentrifuge（assay 前以 1,000 × g 離心 10 min，去除細胞培養上清液）
• ☐ 1.5 mL microcentrifuge tubes（用於標準品序列稀釋）
• ☐ Absorbent paper / lint-free tissue（清洗後用於拍乾 plate）

步驟

1. ☐ 使所有試劑平衡至室溫（30 min）

   將套組成分自 4°C 保存處取出，置於室溫（20–25°C）至少 30 分鐘，使其平衡。 配製 1× Wash Buffer：以 ddH₂O 將 10× 濃縮液按 1:10 稀釋。充分混勻。計算所需體積：300 µL/well × 4 次清洗 × 使用的 well 數（多配 10–20%）。

2. ☐ 復溶並序列稀釋標準品（30 min）

   復溶凍乾標準品：加入 kit 指定體積的 Sample Diluent。靜置 15 分鐘；輕輕倒置混勻，勿以 vortex 混勻。 標記 7 支 microcentrifuge tube（S6 至 S1），另標記一支作為 blank（S0）。 將 Sample Diluent 加入 S6–S1 tube（依 kit 指定體積；常用每管 300 µL）。 依 kit 指定體積，將復溶後的最高濃度標準品（S7）轉移至 S6 tube；上下吸放混勻 10 次。更換 pipette tip。 進行 2 倍序列稀釋：依序由 S6 → S5 → S4 → S3 → S2 → S1 轉移；每次轉移間更換 pipette tip。 S0 僅含 Sample Diluent（0 pg/mL blank）。勿加入標準品。 所有標準品均做重複測定。

3. ☐ 準備樣品（20 min）

   細胞培養上清液：於 4°C 以 1,000 × g 離心 10 min，使碎屑沉澱。收取澄清上清液。立即使用，或分裝後保存於 −80°C；避免超過 2 次凍融。 Serum：室溫凝血 30 min，再以 2,000 × g 離心 10 min。收取上層 serum。 Plasma：將血液收集至含 EDTA 或 heparin 的 tube；以 2,000 × g 離心 10 min。收取上層 plasma。 依需求以 Sample Diluent 稀釋樣品（若分析物濃度未知，先稀釋 2 倍；稀釋後濃度須落在標準曲線線性範圍內）。

4. ☐ 加入標準品與樣品；反應（2 hr or overnight）

   每個 well 加入各標準品（S0–S7）與各樣品 100 µL。安排重複測定；blank（S0）放入 ≥ 2 個 well。 以 adhesive film 封住 plate。 於 plate shaker 上以輕微搖動在室溫反應 2 小時（約 150 rpm）。若要提高靈敏度，改於 4°C 隔夜反應（16–18 h）。 反應後，吸除或彈出 well 內容物。將 plate 用力拍在 absorbent paper 上，移除殘液。

5. ☐ 清洗 plate（第 1 次清洗循環）（5 min）

   每個 well 加入 300 µL Wash Buffer。 浸泡 1–2 分鐘。 吸除或彈出洗液。將 plate 拍在 absorbent paper 上。 共重複至 4 次清洗循環。 最後一次清洗後，翻轉 plate 並用力拍在新的 absorbent paper 上，移除所有殘留 buffer。

6. ☐ 加入 detection antibody；反應（1 hr）

   依 kit 說明，將 biotinylated detection antibody 稀釋至 working concentration（常用以 Sample Diluent 或 Assay Buffer 按 1:100 稀釋）。 每個 well 加入 100 µL。 封住 plate。 於室溫在 plate shaker 上反應 1 小時。 清洗 plate 4 次（程序同 Step 5）。

7. ☐ 加入 HRP-Streptavidin；反應（45 min）

   依 kit 說明將 HRP-Streptavidin 稀釋至 working concentration（常用以 Assay Buffer 按 1:40–1:100 稀釋）。使用前立即配製。 每個 well 加入 100 µL。 封住 plate。避光（以鋁箔覆蓋或置於暗處）。 於室溫在 plate shaker 上反應 45 分鐘。 清洗 plate 4–5 次（此步驟增加至 5 次清洗，以降低 HRP 背景）。

8. ☐ 加入 TMB substrate；顯色（15–30 min）

   每個 well 加入 100 µL TMB Substrate Solution。勿讓 pipette tip 接觸 well 表面。 勿封住 plate。避光。 於室溫反應。監測顯色：analyte 濃度高的 well 應在 5–10 分鐘內轉藍。顯色完成時，最高標準品呈深藍色，blank 無色或僅呈極淡藍。 目標反應時間：總計 15–30 分鐘；blank well 出現可見顏色前即停止。

9. ☐ 終止反應；測定吸光值（15 min）

   依 kit 說明，以與加入 TMB 相同的順序及速度，逐一向各 well 加入 Stop Solution（通常每個 well 50–100 µL）。 輕拍 plate 側面混勻。顏色應一致地由藍轉為黃色。若 well 仍呈綠色或混色，表示混勻不完全——再次輕拍。 加入 Stop Solution 後 15 分鐘內，測定 450 nm（主要波長）與 570 nm（參考波長）的吸光值。 記錄：最終 OD = OD₄₅₀ − OD₅₇₀。

10. ☐ 配適標準曲線並計算濃度

    使用 ELISA reader 軟體或資料分析工具，繪製標準品濃度（X 軸，log scale）與校正 OD（Y 軸）。 以 4-Parameter Logistic（4PL）模型配適。接受曲線前確認 R² > 0.99。 對每個樣品 well：在標準曲線上內插 OD，以取得濃度。 將內插濃度乘以稀釋倍數，換算原始樣品中的濃度。 計算重複測定平均值；回報平均值 ± SD（或 CV%）。