DNA → RNA → PROTEIN · 中心法則 · 原理與操作篇
一段 DNA，怎麼變成會發光的蛋白
細胞把指令存在 DNA，要用的時候先抄成 RNA，再照著 RNA 一個一個接起胺基酸（amino acid），做出蛋白質。這條資訊流叫中心法則（Central Dogma）。本篇跟著一段實驗室天天在用的基因——讓細胞發出綠光的 EGFP——從雙螺旋（double helix）一路走到摺好的蛋白，每一站都看原理、看實驗台上怎麼做、看最容易出錯的地方。
往下捲動，雙螺旋會解開、被抄寫，最後摺成一顆蛋白
三種分子，三個角色
| 分子 | 負責什麼 | 打個比方 | 實驗室怎麼讀它 |
|---|---|---|---|
| DNA | 長期保存遺傳資訊 | 鎖在檔案室的設計圖正本 | PCR、電泳（electrophoresis）、定序（sequencing） |
| RNA | 把需要的那一段抄出來、帶出細胞核（nucleus） | 可以帶去現場的影本 | 反轉錄 PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）、RNA 定序（RNA sequencing, RNA-seq） |
| 蛋白質 | 真正執行功能 | 照著圖做出來的機器 | 蛋白定量（protein quantitation）、SDS-PAGE、Western blot、ELISA |
Crick 在 1958 年把這個方向整理成「中心法則」。它真正的重點是：資訊一旦進了蛋白質，就回不到核酸（nucleic acid）。1970 年發現的反轉錄酶（reverse transcriptase）讓 RNA 也能寫回 DNA，補上了一條路，但沒有推翻這個重點。
一條路線，八個站
它是怎麼被拼出來的
- 1953Watson 與 Crick 參考 Franklin 與 Gosling 的 X 光繞射（X-ray diffraction）照片，提出 DNA 雙螺旋。
- 1958Meselson 與 Stahl 用氮的同位素（isotope）證明 DNA 是半保留複製（semiconservative replication）；同年 Crick 提出中心法則。
- 1961Brenner 等人找到把訊息帶到核糖體（ribosome）的 mRNA；Nirenberg 與 Matthaei 讀出第一個密碼子（codon）：UUU 代表苯丙胺酸（phenylalanine）。
- 1968Okazaki 等人發現延遲股（lagging strand）是一段一段合成的。
- 1970Temin 與 Baltimore 各自發現反轉錄酶：RNA 也能寫回 DNA。
- 1977兩個團隊發現基因被內含子（intron）打斷，mRNA 要經過剪接（splicing）；同年 Sanger 發表雙去氧鏈終止定序法（dideoxy chain-termination sequencing）。
- 1985Saiki 等人發表 PCR；1988 年改用耐熱（thermostable）的 Taq 聚合酶（Taq polymerase），PCR 才能自動化。
年份不用背，要記的是每一個發現補上了資訊流的哪一段。
CHAPTER 1 · DNA STRUCTURE
①雙股、反平行的密碼本
DNA 是兩條很長的鏈纏在一起。每條鏈由四種核苷酸（nucleotide）串成，差別只在鹼基（base）：A、T、G、C。資訊就寫在鹼基的排列順序裡；兩條鏈的鹼基又一一配對，所以只要有其中一條，就能推回另一條。
一個核苷酸＝磷酸＋糖＋鹼基。去氧核糖（deoxyribose）上的碳依序編號，連著磷酸（phosphate）的是 5′ 碳；下一個核苷酸會接在 3′ 碳的羥基（hydroxyl group）上。
串成一條鏈，有頭有尾。磷酸雙酯鍵（phosphodiester bond）把糖和磷酸連成糖磷酸骨架（sugar-phosphate backbone），鹼基朝外伸出。鏈的一端露出 5′ 磷酸，另一端露出 3′ 羥基，所以每條鏈都有方向：從 5′ 讀到 3′。
第二條鏈反向配對。A 對 T，靠兩個氫鍵（hydrogen bond）；G 對 C，靠三個氫鍵。兩條鏈方向相反，叫反平行（antiparallel）：左邊從上往下是 5′→3′，右邊從下往上才是 5′→3′。
扭成右手雙螺旋。常見的 B 型 DNA 每轉一圈約 10.5 個鹼基對（base pair），每一對升高約 0.34 nm，直徑約 2 nm。螺旋表面留下一寬一窄兩道凹槽：大溝（major groove）與小溝（minor groove），許多蛋白就是從大溝「讀」鹼基。
為什麼 GC 多的 DNA 比較難拆開
加熱會打斷鹼基之間的氫鍵，雙股分開成單股，共價骨架不斷，這叫變性（denaturation）。單股吸收 260 nm 紫外光比雙股強（增色效應，hyperchromic effect），所以邊加熱邊量吸光值（absorbance），會畫出一條 S 形的熔解曲線（melting curve）；分開一半時的溫度叫熔解溫度（melting temperature），寫作 Tm。
G–C 對有三個氫鍵，堆疊（base stacking）也比較穩，GC 越多，整條曲線越往右移。慢慢降溫，互補的單股會重新配對，叫復性（renaturation）；PCR 與引子（primer）設計都靠這件事。
小工具裡的 Tm 公式只適合短引子做第一眼判斷。實際設計引子，請用考慮鹽濃度的最近鄰法（nearest-neighbor method）工具，例如 NCBI Primer-BLAST。
實驗台：把 DNA 從細胞裡拿出來
- 裂解（lysis）。用含界面活性劑（detergent）的緩衝液打破細胞膜與核膜（nuclear envelope），加蛋白酶 K（proteinase K） 分解蛋白。
- 去掉 RNA。需要純 DNA 時加 RNase A，把 RNA 分解掉。
- 結合。在高濃度的離液鹽（chaotropic salt；例如胍鹽，guanidinium salt）中，DNA 會吸附到管柱（spin column）的矽膠膜（silica membrane）上。
- 清洗。用含乙醇（ethanol）的緩衝液洗掉鹽與雜質，再空轉離心（dry spin），把乙醇甩乾。
- 沖提（elution）。加低鹽緩衝液（例如 TE）或水，把 DNA 從膜上洗下來。
用吸光值量濃度與純度
核酸在 260 nm 吸收最強，蛋白（其中的芳香族胺基酸，aromatic amino acid）在 280 nm，殘留的胍鹽、酚（phenol）與醣類（carbohydrates）在 230 nm 附近。光徑（path length） 1 cm 時，A260＝1.0 大約等於 50 µg/mL 雙股 DNA、40 µg/mL RNA，或 33 µg/mL 單股 DNA。
| 比值 | 純 DNA | 純 RNA | 偏低代表 |
|---|---|---|---|
| A260/A280 | 約 1.8 | 約 2.0 | 蛋白或酚殘留 |
| A260/A230 | 約 2.0–2.2 | 約 2.0–2.2 | 胍鹽、酚或醣類殘留 |
操作重點
- 量吸光值前，先用同一種溶液歸零（blanking）：用水沖提就用水，用 TE 就用 TE。
- 樣品太濃或太稀，比值都不可靠；太濃先稀釋再量。
- 抽基因組 DNA（genomic DNA） 時避免劇烈震盪與反覆吸打（pipetting），長的 DNA 會被剪碎。
- 乙醇一定要甩乾；殘留的乙醇會抑制後面的 PCR 與酵素反應。
- DNA 分裝後存放在 −20 °C 以下，避免反覆冷凍解凍。
吸光值分不出 DNA 和 RNA，也看不出 DNA 斷了沒有；要確認完整性，還是要跑一片洋菜膠（agarose gel）。
CHAPTER 2 · REPLICATION
②複製：一條變兩條
細胞分裂前，整套 DNA 要完整複製一次。兩股先分開，各自當模板（template），照著配對規則合成新股。每個新的雙螺旋都保留一條舊股、配上一條新股，叫半保留複製。
解旋酶（helicase）在複製起點（origin of replication）把雙股打開。原核生物（prokaryote）通常只有一個複製起點，真核生物（eukaryote）的每條染色體（chromosome）上有很多個。打開的地方形成 Y 字形的複製叉（replication fork）；單股結合蛋白（single-stranded DNA-binding protein, SSB）貼住分開的單股，不讓它們黏回去。
引子酶（primase）先鋪一小段 RNA 引子（RNA primer）。DNA 聚合酶（DNA polymerase）不會從零開始，只能把核苷酸接在現成的 3′ 羥基上，所以每一段新 DNA 都要先有一個引子。
DNA 聚合酶只往 5′→3′ 方向延伸。它沿著模板股（template strand）由 3′ 往 5′ 讀，新股則從 5′ 長向 3′，一個一個照 A–T、G–C 配對接上去。
領導股（leading strand）：順著複製叉，一路連續合成。這條新股的延伸方向剛好和複製叉打開的方向相同，引子鋪一次，就能一直往前接。
延遲股：方向相反，只能一段一段來。另一條新股得背著複製叉的方向合成。複製叉每打開一段，就重新鋪一個引子、往回合成一小段，這些片段叫岡崎片段（Okazaki fragment），在細菌約 1,000–2,000 個核苷酸，在真核細胞約 100–200 個。
換掉引子，連接酶（ligase）封口。RNA 引子被移除、補上 DNA，最後由連接酶把片段之間的缺口接起來，延遲股才變成完整的一條。
抄錯了怎麼辦
DNA 聚合酶除了接核苷酸，還能沿 3′→5′ 方向把剛接錯的那一個切掉，叫校對活性（proofreading activity）。聚合酶本身大約每十萬個核苷酸錯一個；加上校對，降到約千萬分之一；複製完成後再由錯配修復（mismatch repair）系統檢查一次，整體錯誤率可以低到約十億分之一。
漏網的錯誤，就成了突變（mutation）。單一鹼基的改變、插入或缺失會怎麼影響蛋白，第 ⑤ 章會用遺傳密碼（genetic code）來看。
1958 年的實驗：先讓大腸桿菌（Escherichia coli）在含重氮（¹⁵N）的培養基（culture medium）中長很多代，再換到一般的氮（¹⁴N）。用密度梯度離心（density gradient centrifugation）分開，第一代的 DNA 只有一條「中間密度」的帶，第二代出現中間與輕兩條帶，正好符合半保留複製的預測。
PCR：把複製搬進試管
PCR（聚合酶連鎖反應，polymerase chain reaction）借用的就是上面這套規則，只是把解旋酶換成高溫，把引子酶換成人工合成的 DNA 引子。兩條引子分別貼在目標片段的兩端，每跑一個循環，目標片段的數量就加倍。
溫度25 °C
循環0
拷貝數1理想值
配好反應。一管裡要有模板 DNA、一對引子、四種 dNTP、含 Mg²⁺ 的緩衝液，以及耐熱的 DNA 聚合酶（例如 Taq）。
變性，約 95 °C：雙股分開。第一個循環前通常先加熱 2–3 分鐘，讓模板完全打開。
黏合（annealing），約 50–65 °C：引子貼上去。溫度通常設在引子 Tm 減 3–5 °C；太低會黏錯地方，太高引子貼不住。
延伸（extension），72 °C：聚合酶從引子的 3′ 端往後接。Taq 大約每分鐘延伸 1 kb。一個循環結束，目標片段變成兩倍。
重複 25–35 個循環，最後停在平台期（plateau phase）。理想上 n 個循環後是 2ⁿ 倍，30 個循環約十億倍；但試劑會用完、產物也會互相干擾，後段不再加倍。
| 成分 | 常用終濃度（final concentration） | 作用 |
|---|---|---|
| 模板 DNA | 基因組 DNA 約 10–100 ng；質體（plasmid）只要 pg–ng | 提供要複製的序列 |
| 引子（每條） | 0.1–0.5 µM | 決定複製哪一段 |
| dNTP | 各 200 µM | 新股的原料 |
| Mg²⁺ | 1.5–2.5 mM | 聚合酶的輔因子（cofactor）；太多會降低專一性（specificity） |
| Taq 聚合酶 | 每 50 µL 約 1.25 U | 負責延伸 |
用量依聚合酶廠商的說明書調整；高保真聚合酶（high-fidelity polymerase）的條件和 Taq 不同。
引子怎麼設計
- 長度 18–25 個核苷酸。太短不專一，太長不易黏合完全。
- GC 比例約 40–60%。兩條引子的 Tm 相差在 5 °C 以內，通常落在 55–65 °C。
- 3′ 端要穩，但不要太黏。最後幾個鹼基有 1–2 個 G 或 C，但不要連續三個以上。
- 自己和彼此都不能互補。特別是 3′ 端，否則會黏成引子二聚體（primer dimer）。
- 用 Primer-BLAST 檢查。確認引子只會黏在目標上。
跑一片洋菜膠看結果
DNA 骨架上的磷酸帶負電，在電場中往正極（anode）移動；洋菜膠的網孔讓小片段跑得快、大片段跑得慢。和分子量標記（molecular weight marker, ladder）比，就能讀出產物大約多長。常用 1–2% 的膠，片段越小，膠的濃度越高。把 EGFP 的完整編碼區（coding sequence, CDS；720 bp）放大出來，膠上應該在 ladder 的 700 bp 附近看到一條清楚的帶。
操作重點
- 每次都放無模板對照（no-template control, NTC）：只加水、不加模板，這一管不應該有任何產物。
- PCR 前和 PCR 後分區操作，使用含濾芯的吸頭（pipette tip）；放大後的產物是最常見的污染源。
- 試劑放冰上配，先配一管總量（master mix）再分裝，減少每管的差異；聚合酶最後才加。
- 跑膠時注意方向：DNA 從負極（cathode；黑）往正極（紅）跑，上樣孔（loading well）要放在黑色那一端。
CHAPTER 3 · TRANSCRIPTION
③轉錄：抄一份工作副本
細胞不會把 DNA 正本拿去用，而是只把需要的那個基因抄成 RNA。抄寫的是 RNA 聚合酶（RNA polymerase）；從哪裡開始抄，由基因前面的啟動子（promoter）決定。
轉錄因子（transcription factor）先認出啟動子。許多真核基因的啟動子，在起點上游約 25–30 個鹼基處有一段 TATA box；轉錄因子結合上去之後，才把 RNA 聚合酶 II 帶到起點。
RNA 聚合酶打開一小段雙股。它在 DNA 上撐開一個十幾個鹼基對的轉錄泡（transcription bubble），而且不需要引子就能開始接。
照著模板股接出 RNA。RNA 從 5′ 往 3′ 延長，用 U 取代 T 和 A 配對。被讀的那一股叫模板股；另一股叫編碼股（coding strand），它的序列和 RNA 一樣，只是 T 換成 U。
一邊前進，一邊讓 DNA 合回去。新的 RNA 從聚合酶後方離開，打開的 DNA 在後面重新配成雙股，正本完全沒有被消耗。
抄到終點就放開。細菌靠終止序列（terminator）讓聚合酶脫離；真核的前驅 mRNA（precursor mRNA, pre-mRNA） 則在 poly(A) 訊號（polyadenylation signal, AAUAAA）下游被切開，聚合酶隨後脫離。
哪一股是模板？讀序列最常搞錯的地方
資料庫裡的基因序列，通常寫的是編碼股（5′→3′），和 mRNA 只差在 T 與 U。所以拿到一段基因序列，直接把 T 換成 U 就是 mRNA，不需要先取互補。真正被聚合酶讀的模板股，是它的反向互補（reverse complement）。
| 原核（細菌） | 真核 | |
|---|---|---|
| RNA 聚合酶 | 一種，靠 σ 因子（sigma factor）認出啟動子 | 三種：Pol I（大型 rRNA）、Pol II（mRNA）、Pol III（tRNA、5S rRNA） |
| 啟動子 | −10 與 −35 兩段序列 | TATA box 等核心元件，加上遠處的增強子（enhancer） |
| 在哪裡轉錄（transcription） | 細胞質（cytoplasm），可以邊轉錄邊轉譯（translation） | 細胞核，加工完才送出 |
| 一條 mRNA | 常帶好幾個基因（操縱組，operon） | 通常只有一個基因 |
調控：決定抄不抄、抄多少
同一個人身上，每個細胞的 DNA 幾乎一樣；肝細胞和神經細胞的差別，在於哪些基因被轉錄。轉錄因子可以當活化子（activator），也可以當抑制子（repressor）；增強子能從很遠的地方影響啟動子。舉例來說，NF-κB 平常被 IκB 扣在細胞質，細胞受到刺激後 IκB 被分解，NF-κB 進入細胞核、結合到 κB 位點，開啟發炎相關的基因。
序列上找得到 κB 位點，不等於那個基因一定會被打開：轉錄因子要有活性、要進到細胞核，那段 DNA 也要能被接觸到。
CHAPTER 4 · RNA PROCESSING
④RNA 加工：戴帽、剪接、加尾
真核細胞剛抄好的是前驅 mRNA，還不能直接用。它要先戴上 5′ 帽（5′ cap）、剪掉內含子、加上 poly(A) 尾（poly(A) tail），變成成熟 mRNA（mature mRNA），才會被送出細胞核。
前驅 mRNA：外顯子（exon）被內含子隔開。以 β-球蛋白（β-globin）基因（HBB）為例，三個外顯子之間夾著兩個內含子，內含子加起來比外顯子還長。
戴上 5′ 帽。轉錄才開始不久，RNA 的 5′ 端就接上一個甲基化的鳥嘌呤（7-methylguanosine, m⁷G）。它保護 RNA 不被分解，也是核糖體辨認的起點。
剪接體（spliceosome）認出內含子的邊界。內含子絕大多數以 GU 開頭、AG 結尾；剪接體由小分子核 RNA（small nuclear RNA, snRNA）和蛋白組成，抓住這兩端，以及內含子中段的分支點（branch point）。
內含子被剪成套索（lariat），外顯子接起來。內含子繞成套索被切下、分解；兩側的外顯子精準接合，一個鹼基都不能差，否則後面的密碼會全部讀錯。
加上 poly(A) 尾，送出細胞核。3′ 端在 poly(A) 訊號下游被切開，接上一長串 A，哺乳類細胞約兩百多個。成熟 mRNA 由 5′ 帽、5′UTR、編碼區（CDS）、3′UTR 和 poly(A) 尾組成。
選擇性剪接：同一個基因，不同的蛋白
外顯子不一定全部保留。同一段前驅 mRNA 可以跳過或保留某些外顯子，接成不同的成熟 mRNA，做出不同的蛋白。人類大多數含有多個外顯子的基因都會選擇性剪接（alternative splicing），這是約兩萬個蛋白質編碼基因（protein-coding gene）能做出更多種蛋白的原因之一。
RNA 不只有 mRNA
- mRNA：帶著編碼區，告訴核糖體要接哪些胺基酸。
- tRNA：一端是反密碼子（anticodon），另一端掛著胺基酸，負責對號入座。
- rRNA：核糖體的主要成分；接胺基酸的化學反應就是由 rRNA 催化。
- snRNA：剪接體的成員。
- miRNA、lncRNA 等非編碼 RNA（non-coding RNA）：不做成蛋白，但會調控其他基因的表現。
實驗台：RNA 為什麼特別難抽
RNA 的核糖（ribose）多一個 2′ 羥基，化學上比 DNA 容易斷。更麻煩的是 RNA 分解酶（ribonuclease, RNase）無所不在：手上、汗液和灰塵裡都有，而且非常耐熱，高壓滅菌（autoclaving）也不一定能讓它失去活性。抽 RNA 的每一個動作，都是在和 RNase 賽跑。
- 立刻處理。樣品取下後馬上裂解，或放進 RNA 保存液（RNA stabilization solution）、液態氮（liquid nitrogen），讓細胞裡的 RNase 來不及作用。
- 胍鹽與酚裂解。例如 TRIzol：胍鹽讓 RNase 變性，酚把蛋白帶走。
- 加氯仿離心分層。RNA 留在上層水相（aqueous phase），DNA 和蛋白在中間層與下層。
- 沉澱（precipitation）與清洗。用異丙醇（isopropanol）沉澱 RNA，75% 乙醇清洗，稍微風乾後溶在無 RNase 的水裡。
- 去除 DNA。用 DNase 處理，去掉殘留的基因組 DNA，再進行反轉錄。
純 RNA 的 A260/A280 約 2.0。完整性要看電泳：真核細胞的總 RNA（total RNA） 會出現 28S 與 18S 兩條 rRNA 帶，28S 的亮度約為 18S 的兩倍；帶變模糊、往下拖尾（smearing），就是 RNA 已經降解（degradation）。自動化電泳儀會給一個 1–10 的 RIN 分數，越高越完整。
操作重點
- 全程戴手套並經常更換；用無 RNase 的吸頭、離心管和水。
- 在冰上操作；檯面與移液器（pipette）先用 RNase 去除劑擦過。
- 不要對著打開的管子說話，也不要碰管口內側。
- RNA 分裝存放在 −80 °C，避免反覆冷凍解凍。
- 反轉錄時保留一管不加反轉錄酶的對照（−RT）；它如果出現產物，表示有基因組 DNA 污染。
反轉錄：把 RNA 寫回 DNA
RNA 太脆弱，也不能直接拿去 PCR。實驗室用反轉錄酶把 mRNA 寫回互補 DNA（complementary DNA, cDNA），再拿 cDNA 做 PCR 或定量 PCR（quantitative PCR, qPCR）。這一步正是中心法則的「例外」，也是反轉錄病毒（retrovirus）在細胞裡做的事。起始的引子可以選 oligo(dT)（貼在 poly(A) 尾上）、隨機六聚體（random hexamer；貼在任何地方），或只針對目標基因的專一引子。
CHAPTER 5 · THE GENETIC CODE
⑤遺傳密碼：三個字一組
mRNA 只有四種字母，蛋白質卻有二十種胺基酸。兩個字母一組只有 16 種組合，不夠用；三個一組有 64 種，綽綽有餘。這三個鹼基一組，叫密碼子。
由內往外讀。第一個鹼基在最內圈，第二個在中圈，第三個在外圈。例如 AUG：先找 A，再找 U，最後找 G，就讀到甲硫胺酸（methionine, Met）。
AUG 是起點。它代表甲硫胺酸，也是轉譯開始的訊號，所以幾乎每個新合成的蛋白，第一個胺基酸都是 Met（之後可能被切掉）。
UAA、UAG、UGA 是終點。這三個終止密碼子（stop codon）不代表任何胺基酸，核糖體讀到就停止轉譯。
一個胺基酸可以有好幾種寫法。64 個密碼子裡，61 個對應 20 種胺基酸，所以多數胺基酸不只一個密碼子，這叫簡併性（degeneracy）。白胺酸（leucine, Leu）、絲胺酸（serine, Ser）、精胺酸（arginine, Arg）各有六個；差別常常只在第三個字母。
讀框：從哪裡開始數，決定一切
同一段序列，從第 1、第 2 或第 3 個鹼基開始三個三個數，會得到三種完全不同的讀法；加上反向互補的那一股，一共六個讀框（reading frame）。真正的編碼讀框，通常從 AUG 開始、中間沒有終止密碼子，而且夠長。ORF Finder 做的就是這件事。
預設序列是 EGFP 的編碼區。在 +1 讀框，它從 AUG 開始，一路接了 239 個胺基酸才遇到終止密碼子 UAA；換成 +2 讀框，第二個密碼子就是終止。有趣的是 +3 和 −1 讀框：整段都沒有終止密碼子，卻也找不到任何一個 AUG 可以起頭。判斷讀框不能只看「有沒有停」，還要看「從哪裡開始」。
這個小工具只用標準遺傳密碼；粒線體和部分生物使用的密碼略有不同。正式分析請用 NCBI ORF Finder 或 ExPASy Translate，並回頭核對 GenBank 的 CDS 註解。
錯一個字，會怎樣
第 ② 章說過，複製的錯誤會留下突變。拿 EGFP 開頭的幾個密碼子來看，同一段序列的四種改變：
同義突變（silent mutation）
字改了，意思沒變
第 2 個密碼子 GUG 變成 GUC，仍然是纈胺酸（valine, Val）。胺基酸沒變，不等於完全沒影響：它仍可能改變剪接或 mRNA 的穩定性。
錯義突變（missense mutation）
換成另一個胺基酸
第 6 個密碼子 GAG 變成 GUG，麩胺酸（glutamate, Glu）換成纈胺酸（Val）。鐮刀型貧血症（sickle cell disease）就是 β-球蛋白第 6 個胺基酸發生同樣的改變：血紅素（hemoglobin）在缺氧時聚集，紅血球（red blood cell）被撐成鐮刀狀。
無義突變（nonsense mutation）
提早出現句號
第 4 個密碼子 AAG（離胺酸，lysine）變成 UAG，是終止密碼子。轉譯接了三個胺基酸就停下，做不出 EGFP。
移碼突變（frameshift mutation）
少一個字，後面全錯
刪掉第 9 個鹼基，從第 3 個密碼子開始全部錯位：M-V-S-K-G-E 變成 M-V-R-R-A-R，之後通常很快撞上終止密碼子。插入或缺失的數目只要不是 3 的倍數，就會移碼。
CHAPTER 6 · TRANSLATION
⑥轉譯：核糖體把密碼接成胺基酸鏈
成熟 mRNA 離開細胞核以後，由核糖體一次讀一個密碼子。負責對號入座的是 tRNA：它一端用反密碼子認出密碼子，另一端掛著對應的胺基酸。
先把胺基酸掛上 tRNA。每一種胺基酸都有專屬的胺醯-tRNA 合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase），用 ATP 的能量，把正確的胺基酸接到正確的 tRNA 上。這一步配錯，後面就會照著錯的接。
小次單元（small subunit）找到起始密碼子（start codon） AUG。真核細胞的核糖體小次單元從 5′ 帽開始往下游掃描，遇到第一個合適的 AUG 停下；帶著甲硫胺酸的起始 tRNA（initiator tRNA） 在這裡和它配對。細菌則靠 AUG 上游的 Shine-Dalgarno 序列定位。
大次單元（large subunit）加入，核糖體組好。核糖體上有三個位置：A 位（A site）迎接新進的 tRNA，P 位（P site）握著正在延長的胺基酸鏈，E 位（E site）讓用完的 tRNA 離開。
對上密碼子的 tRNA 進入 A 位。只有反密碼子和 A 位密碼子互補的那一支 tRNA 會留下來。
形成肽鍵（peptide bond）。P 位上的胺基酸鏈被接到 A 位 tRNA 的胺基酸上，鏈就長了一個。催化這個反應的是核糖體 RNA（ribosomal RNA, rRNA），不是蛋白，所以核糖體本身就是一個核酶（ribozyme）。
核糖體往前移一格，直到終止密碼子。tRNA 從 A 位移到 P 位，P 位上空的 tRNA 移到 E 位離開，A 位露出下一個密碼子。讀到終止密碼子時沒有 tRNA 能配對，改由釋放因子（release factor）進入 A 位，把整條胺基酸鏈放開，核糖體拆回兩個次單元。
一條 mRNA，同時被很多核糖體讀
一個核糖體離開起點後，下一個核糖體就能接著上來，形成多核糖體（polysome），所以一條 mRNA 可以同時做出好幾個蛋白。細菌沒有細胞核，mRNA 一邊被轉錄，核糖體就一邊開始轉譯。
| 細菌 | 真核 | |
|---|---|---|
| 核糖體 | 70S（30S＋50S） | 80S（40S＋60S） |
| 怎麼找到起點 | Shine-Dalgarno 序列 | 從 5′ 帽掃描到 AUG |
| 第一個胺基酸 | 甲醯甲硫胺酸（N-formylmethionine, fMet） | 甲硫胺酸（Met） |
兩種核糖體不一樣，是許多抗生素（antibiotic；例如四環素 tetracycline、紅黴素 erythromycin）能選擇性抑制細菌的原因之一。實驗室要在大腸桿菌裡表現 EGFP，也得把基因接在細菌認得的啟動子與 Shine-Dalgarno 序列後面。
CHAPTER 7 · FOLDING
⑦摺疊：從一條鏈到會發光的結構
剛離開核糖體的是一條胺基酸鏈。它的順序已經決定了它會摺成什麼形狀，形狀又決定功能。EGFP 是最好的例子：同一條 239 個胺基酸的鏈，摺好之後才會發光。
一級結構（primary structure）：胺基酸的排列順序。從 N 端（N-terminus）到 C 端（C-terminus），由肽鍵串起來。EGFP 的順序從 M-V-S-K-G-E-E 開始。
二級結構（secondary structure）：骨架上的氫鍵，形成 α 螺旋（α-helix）與 β 摺板（β-sheet）。這兩種是最常見的局部形狀；EGFP 的骨架大部分是 β 摺板。
三級結構（tertiary structure）：整條鏈摺成立體。EGFP 的 11 條 β 股（β-strand）圍成一個桶子，直徑約 2.4 nm、長約 4.2 nm，一條螺旋從桶子中央穿過。
發光團（chromophore）在桶子裡自己形成。中央螺旋上的三個胺基酸（依 GFP 原始編號第 65–67 號，EGFP 是 Thr-Tyr-Gly）自行環化（cyclization），再經氧氣氧化，變成會吸收藍光、放出綠光的發光團：以 488 nm 激發（excitation），放出約 507 nm 的綠光。整個過程不需要其他酵素，所以 EGFP 放進各種細胞都能亮。
四級結構（quaternary structure）：好幾條鏈組成一個蛋白。EGFP 單獨一條就有功能；血紅素則由兩條 α 鏈和兩條 β 鏈組成，任何一條出問題都會影響整體。
摺錯了怎麼辦
細胞裡很擠，新生的胺基酸鏈容易彼此黏住。分子伴護蛋白（molecular chaperone）會包住還沒摺好的鏈，給它時間摺對；摺不回來的蛋白會被標記、送去分解。摺錯的蛋白如果堆積下來，與阿茲海默症（Alzheimer's disease）、帕金森氏症（Parkinson's disease）等疾病有關。
蛋白摺好之後，還可能被加上醣類或磷酸，或被切掉一段，這些叫轉譯後修飾（post-translational modification），會改變它的活性、位置或壽命。
從序列預測結構：AlphaFold
從胺基酸序列預測立體結構，曾是生物學最難的問題之一。AlphaFold2 在 2020 年的 CASP14 結構預測比賽中，對多數蛋白的預測已接近實驗解出的結構。它會替每個位置給一個信心分數（confidence score, pLDDT）；分數低的區段，常常是本來就柔軟、不固定的地方，不一定是預測錯了。預測終究是預測，重要的結論仍要回到實驗確認。
在 SDS-PAGE 裡把蛋白攤成一條直線，等於把這一章倒著做一遍：EGFP 一旦加熱變性，就不再發光。
CHAPTER 8 · READING EACH LAYER
⑧在實驗室裡看見每一層
中心法則的每一層，都有對應的實驗方法。先想清楚你要問的是哪一層，再選方法。
DNA
基因在不在？序列對不對？
- PCR 與洋菜膠電泳
- Sanger 定序、次世代定序（next-generation sequencing, NGS）
- Southern blot（現在較少用）
RNA
基因有沒有打開？開了多少？
- 反轉錄 PCR 與定量 PCR
- RNA 定序
- Northern blot（現在較少用）
蛋白質
蛋白做出來了嗎？多少？多大？
- 蛋白定量（Bradford 等）
- SDS-PAGE 與 Western blot
- ELISA
- 質譜（mass spectrometry）
三層的量不一定同步。mRNA 增加，蛋白不一定跟著增加，中間還隔著轉譯效率（translation efficiency）、蛋白分解與修飾。所以一個站得住的結論，常常同時看 mRNA 與蛋白。
CHAPTER 9 · TROUBLESHOOTING
⑨出錯了怎麼看
核酸實驗的失敗，大多會在膠上或吸光值上留下痕跡。先認形狀，再往回找是哪一站出了問題。
RNA 萃取
RNA 一路拖尾，看不到兩條 rRNA 帶
可能原因：RNase 污染、樣品沒有立刻處理、反覆冷凍解凍。
先試試：重新取樣並立刻保存；全程用無 RNase 耗材，在冰上操作。
RNA 萃取
孔附近多出一條很大的帶
可能原因：基因組 DNA 殘留。
先試試：用 DNase 處理；反轉錄時加一管 −RT 對照確認。
PCR
什麼帶都沒有，只有 ladder
可能原因：黏合溫度太高、引子設計錯誤、模板太少或帶有抑制物（inhibitor；殘留的乙醇或酚）、漏加試劑。
先試試：用溫度梯度（temperature gradient）找黏合溫度；放一管已知會成功的陽性對照（positive control）；檢查模板的 A260/A230。
PCR
底部一團模糊的小帶
可能原因：引子二聚體——兩條引子互相黏合後被延伸，長度通常小於 100 bp。
先試試：降低引子濃度、提高黏合溫度，或重新設計 3′ 端。
PCR
好幾條大小不一的帶
可能原因：黏合溫度太低、Mg²⁺ 太多、循環數太多。
先試試：提高黏合溫度、降低 Mg²⁺，或改用熱啟動聚合酶（hot-start polymerase）。
PCR
無模板對照也有帶
可能原因：試劑、吸頭或環境被先前的 PCR 產物污染。
先試試：換新的分裝試劑與水；PCR 前後分區、用濾芯吸頭，並清潔檯面。
定量
A260/A230 很低
可能原因：胍鹽、酚或醣類殘留。
先試試：多洗一次並確實甩乾，或重新沉澱。
定量
A260/A280 偏低
可能原因：蛋白或酚殘留。
先試試：再做一次清洗或萃取；確認歸零用的是同一種溶液。
自我檢核（先想，再點開）
一段基因的編碼股是 5′-ATG GTG AGC-3′，它的 mRNA 是什麼？
答：5′-AUG GUG AGC-3′。mRNA 和編碼股序列相同，只把 T 換成 U；模板股才是它的反向互補。
為什麼延遲股要分成一段一段的岡崎片段？
答：DNA 聚合酶只能往 5′→3′ 延伸。延遲股的合成方向和複製叉打開的方向相反，只能等複製叉打開一段、鋪一次引子、往回合成一小段，最後由連接酶接起來。
PCR 的無模板對照（NTC）出現產物，代表什麼？
答：有污染。這一管沒有加模板，任何產物都來自試劑、吸頭或環境中殘留的 DNA，同一批的結果都不可信。
把 EGFP 第 4 個密碼子 AAG 的 A 換成 U，會發生什麼事？
答：變成 UAG，是終止密碼子。轉譯接了三個胺基酸就停下，得到的只是一個很短的胜肽（peptide），不會發光，這是無義突變。
把 EGFP 加熱變性後跑 SDS-PAGE，膠上的帶還會發出綠光嗎？
答：通常不會。發光團要靠完整的 β 桶（β-barrel）保護；加熱變性後結構散開，即使胺基酸順序完全沒變，也不再發光。形狀決定功能。
帶走這三句
- DNA 存正本、RNA 是影本、蛋白是機器；資訊只往蛋白質的方向走。
- 所有聚合酶都只往 5′→3′ 延伸：複製、PCR、轉錄與反轉錄都一樣。
- 讀框與摺疊（folding）決定結果：錯一個字可能沒事，也可能讓整個蛋白報廢。