Primer、Probe 與 Plasmid 設計
以證據為先的分子生物學設計工具：PCR／qPCR primer、hydrolysis、MGB 與 molecular beacon probe，以及含註解、限制酶分析與組裝檢查的 plasmid 圖譜。每項判定都可展開看到來源。
Assay 類型決定 amplicon 要對照哪一組已載明來源的範圍。兩組範圍沒有重疊，工具不代為選擇。
填入目標序列上已知 SNP 的 1-based 位置，以逗號分隔。落在 primer 3' 端 5 nt 內的變異判為需留意，其他位置的單一變異判為可接受。工具沒有變異資料庫，只檢查你填入的位置。
搜尋條件
選填。填入 1-based 起迄位置，所有候選 amplicon 都必須完整覆蓋此區間。
反應條件
Tm 依最近鄰熱力學計算並校正鹽濃度與 DMSO。文獻報告在 PCR 條件下的標準誤約 1.8 °C，請視為估計值。
- 建議範圍
- 本項無數值門檻，僅作提示
- 理由
- 單價鹽以 ΔS 的 0.368 × (N−1) × ln[Na⁺] 項校正。Mg²⁺ 與 dNTP 換算為單價等效濃度 [Na⁺]eq = [Mon⁺] + 120 × √([Mg²⁺] − [dNTP])（單位 mmol/L）。DMSO 以每 1%（v/v）降低 0.75 °C 計入。
- 證據層級
- 原始研究文獻
文獻來源
- SantaLucia J (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci U S A 95(4):1460-5PMID 9465037DOI 10.1073/pnas.95.4.1460
- von Ahsen N, Wittwer CT, Schütz E (2001). Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg(2+), deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas. Clin Chem 47(11):1956-61PMID 11673362
- Owczarzy R, Moreira BG, You Y, Behlke MA, Walder JA (2008). Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry 47(19):5336-53PMID 18422348DOI 10.1021/bi702363u
限制與衝突: von Ahsen 等人報告在 PCR 條件下完全配對雙鏈的標準誤約 1.8 °C。預測 Tm 應視為帶此量級不確定性的估計值，不是精確的退火溫度。
目前設定可能造成的影響
目前設定都在建議範圍內。
請先貼上序列。
最成熟、文獻支持最充分的 qPCR 偵測流程。Probe 結合於兩條 primer 之間，延伸時被 5'-nuclease 活性切斷而產生訊號。
不同化學修飾的設計規則來自不同機制，工具分開判定，不會把一種修飾的範圍套到另一種。
Assay 脈絡
選填。填入後才會判定 probe Tm 與 primer Tm 的關係。
選填，1-based。填入 primer 在此序列上的位置，候選 probe 不會與這些區間重疊。格式：起-迄，多組以逗號分隔，例如 1-20, 130-148。
填入目標序列上已知變異的 1-based 位置，以逗號分隔。落在 probe 下方且距任一端 1–2 個鹼基的變異判為需留意（You 等人 2006 的規則 v）。
以未修飾 DNA 的最近鄰參數計算 Tm 與二級結構。
反應條件
Tm 依最近鄰熱力學計算並校正鹽濃度與 DMSO。文獻報告在 PCR 條件下的標準誤約 1.8 °C，請視為估計值。
- 建議範圍
- 本項無數值門檻，僅作提示
- 理由
- 單價鹽以 ΔS 的 0.368 × (N−1) × ln[Na⁺] 項校正。Mg²⁺ 與 dNTP 換算為單價等效濃度 [Na⁺]eq = [Mon⁺] + 120 × √([Mg²⁺] − [dNTP])（單位 mmol/L）。DMSO 以每 1%（v/v）降低 0.75 °C 計入。
- 證據層級
- 原始研究文獻
文獻來源
- SantaLucia J (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci U S A 95(4):1460-5PMID 9465037DOI 10.1073/pnas.95.4.1460
- von Ahsen N, Wittwer CT, Schütz E (2001). Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg(2+), deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas. Clin Chem 47(11):1956-61PMID 11673362
- Owczarzy R, Moreira BG, You Y, Behlke MA, Walder JA (2008). Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry 47(19):5336-53PMID 18422348DOI 10.1021/bi702363u
限制與衝突: von Ahsen 等人報告在 PCR 條件下完全配對雙鏈的標準誤約 1.8 °C。預測 Tm 應視為帶此量級不確定性的估計值，不是精確的退火溫度。
目前設定可能造成的影響
目前設定都在建議範圍內。
請先貼上序列。
GenBank 記錄會自動讀取 LOCUS 行的拓撲宣告；貼入純序列或 FASTA 時可手動指定。
分析選項
預設 100 個胺基酸。這是報告慣例而非生物學門檻；比這更短的真實 ORF 會被略過。
組裝規劃
請先貼上序列。