Griess nitrite 定量分析（Griess nitrite assay；間接 nitric oxide 測定）

以比色 microplate assay 定量無細胞培養上清液中的 nitrite（NO2-），此為 nitric oxide（NO）的穩定終末代謝物。在酸性條件下，nitrite 使 sulfanilic acid 重氮化；形成的 diazonium salt 再與 N-(1-naphthyl)ethylenediamine（NEDA）偶合，形成粉紅色 azo dye，並於 540-548 nm 附近讀值。濃度由基質匹配 sodium nitrite（NaNO2）標準曲線（0-100 uM）內插求得，並使用僅含培養基的 blank。此分析作為受刺激細胞（例如 LPS 活化 macrophage）NO 產生量的指標。

biochemistry 入門 45 分鐘 8 步驟

階段 01 / 05準備

配製 Griess 試劑與 nitrite stock

酸化 sulfanilic acid 與 NEDA 為兩種 Griess reagent；sodium nitrite stock 提供 working standard。

完成
STEP 1配製兩種 Griess 試劑15 分鐘
配製 1% (w/v) sulfanilic acid：將 0.5 g sulfanilic acid 溶於 50 mL 2.5% (v/v) phosphoric acid 中。配製 0.1% (w/v) NEDA：將 0.05 g NEDA 溶於 50 mL ddH2O 中。將兩種試劑轉移至琥珀色 bottle 或鋁箔包覆 bottle，並持續避光直到使用。

為什麼酸化的 sulfanilic acid 形成 diazonium intermediate，NEDA 則是偶合胺；兩種溶液構成完整的 Griess reagent 組。
注意NEDA 與 working solution 會受光影響並隨時間降解。請避光並儘速使用；稀釋後試劑不可長時間於室溫保存。
完成
STEP 2配製 NaNO2 stock 與中間稀釋液5 分鐘
配製 1 M NaNO2 stock：將 0.069 g NaNO2 溶於 1 mL ddH2O 中。以 ddH2O 將 1 M stock 稀釋 1:100，取得 10 mM NaNO2。以培養基將 10 mM 溶液稀釋 1:100，取得 100 uM working standard。

為什麼Nitrite 是 NO 的穩定且可測量氧化產物；定濃度 NaNO2 系列作為標準品，可將吸光值換算為濃度。

階段 02 / 05上樣

將基質匹配標準品與上清液加入 microplate

無細胞上清液中的 nitrite 累積量可反映受刺激細胞的 nitric oxide 產生量。標準品與 blank 使用與樣品相同的培養基。

完成
STEP 3建立 nitrite 標準曲線10 分鐘
從 100 uM working standard，以培養基配製 0、6.25、12.5、25、50、100 uM 標準品。使用未稀釋培養基作為 0 uM blank。每種標準品分注 100 uL 至 well，做重複或三重複。

為什麼以與樣品相同的培養基配製標準品（基質匹配），可校正培養基吸光值與基質效應，提升校正準確度。
注意請以培養基配製標準曲線，不可使用 ddH2O。水溶液標準曲線會造成培養基樣品定量錯誤。
完成
STEP 4加入樣品5 分鐘
將每份無細胞上清液分注 100 uL 至 well，做重複或三重複。加入與樣品培養基相符的僅含培養基的 blank。

為什麼重複 well 可界定分析精密度，而匹配的 blank 可設定扣除用的零基線。

階段 03 / 05重氮化

sulfanilic acid 使 nitrite 重氮化

在酸性條件下，nitrite 使 sulfanilic acid 形成 diazonium salt。固定反應五分鐘，讓各 well 的第一反應步驟保持一致。

完成
STEP 5加入 sulfanilic acid 並進行重氮化5 分鐘
將 50 uL 的 1% sulfanilic acid 加入所有 well（標準品與樣品）。輕輕混勻，於室溫反應 5 min，全程避光。

為什麼在酸性條件下，nitrite 使 sulfanilic acid 轉化為 diazonium salt；此為 Griess reaction 的第一個速率決定步驟。

階段 04 / 05偶合

加入 NEDA 形成 azo dye

NEDA 與 diazonium salt 偶合，形成粉紅色 azo dye；其吸光值隨 nitrite 濃度變化。

完成
STEP 6加入 NEDA 顯色5 分鐘
將 50 uL 的 0.1% NEDA 加入所有 well。輕輕混勻，並在室溫下使粉紅色 azo dye 顯色（~5-10 min），全程避光。

為什麼NEDA 與 diazonium salt 偶合，形成粉紅色 azo dye，其吸光值與 nitrite 濃度成正比。

階段 05 / 05判讀

測定吸光值並內插 nitrite 濃度

在 548 nm 附近測定顯色後樣品吸光值，扣除培養基 blank，再由基質匹配標準曲線內插樣品 nitrite。

完成
STEP 7測定吸光值2 分鐘
使用 microplate reader 於 548 nm 測定 OD（可接受範圍 540-570 nm）；若設備支援，使用 570 nm 作為參考波長。 NEDA 加入後，在單一且短的時間範圍內讀取所有 well。

為什麼azo dye 在 540-548 nm 附近達最大吸收；依固定時程讀值可讓所有 well 的顯色程度相近。
注意請依相同時程完成顯色與讀值。時間錯開會使樣品間比較產生偏差。
完成
STEP 8計算 nitrite 濃度5 分鐘
從每個 well 的 OD 扣除 0 uM blank。以扣除 blank 後的 OD 對標準品 nitrite 濃度（uM）進行 linear regression；記錄 R2。以內插法計算每份樣品：C (uM) = (OD_sample - b) / m，其中 m 為標準曲線斜率，b 為截距。

為什麼上清液中的 nitrite 累積量，是細胞 NO 產生量經驗證的替代指標；以基質匹配標準曲線內插，可將 OD 換算為濃度。

Griess nitrite 定量分析（Griess nitrite assay；間接 nitric oxide 測定）

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材料

☐ Sulfanilic acid：0.5 g（溶於 50 mL 2.5% (v/v) phosphoric acid 中，配製成 1% (w/v) sulfanilic acid reagent；轉入琥珀色 bottle 或鋁箔包覆 bottle 保存並避光。）
☐ Phosphoric acid (H3PO4), 2.5% (v/v)：50 mL（用於酸化 sulfanilic acid reagent 的稀釋液；提供重氮化所需的酸性條件。）
☐ N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NEDA, also "NED")：0.05 g（溶於 50 mL ddH2O 中，配製成 0.1% (w/v) NEDA reagent；具光敏性，避光保存，並新鮮配製或於 4 C 短期保存。）
☐ Sodium nitrite (NaNO2)：0.069 g（溶於 1 mL ddH2O 中，配製成 1 M stock（MW 69.0 g/mol）；作為標準曲線的主要標準品。）
☐ Culture medium (sample matrix)：依需要（與實驗樣品上清液使用相同的培養基；用於配製所有標準品及 0 uM blank（基質匹配）。）
☐ Deionized water (ddH2O)：依需要（僅用於初始 NaNO2 stock 與 10 mM 中間稀釋液。）
☐ Test supernatant：每 well 100 uL（無細胞培養上清液；新鮮使用，或於 -80 C 保存至測定。）

設備

☐ Microplate reader (ELISA reader)（於 548 nm 讀取吸光值（可接受範圍 540-570 nm）；若設備支援，使用 570 nm 作為參考波長。）
☐ Non-coated, non-binding 96-well microplate (flat-bottom)（避免使用高蛋白結合性或經組織培養處理的高結合性 plate，以免讀值失真。）
☐ Micropipettes and a multichannel pipette（用於準確分注 50-100 uL 及平行加入試劑。）
☐ Volumetric flasks / graduated tubes（用於試劑與標準品配製。）
☐ Amber bottles or aluminum foil（在配製與保存期間保護光敏試劑。）

步驟

☐ 配製兩種 Griess 試劑（15 min）
配製 1% (w/v) sulfanilic acid：將 0.5 g sulfanilic acid 溶於 50 mL 2.5% (v/v) phosphoric acid 中。配製 0.1% (w/v) NEDA：將 0.05 g NEDA 溶於 50 mL ddH2O 中。將兩種試劑轉移至琥珀色 bottle 或鋁箔包覆 bottle，並持續避光直到使用。
☐ 配製 NaNO2 stock 與中間稀釋液（5 min）
配製 1 M NaNO2 stock：將 0.069 g NaNO2 溶於 1 mL ddH2O 中。以 ddH2O 將 1 M stock 稀釋 1:100，取得 10 mM NaNO2。以培養基將 10 mM 溶液稀釋 1:100，取得 100 uM working standard。
☐ 建立 nitrite 標準曲線（10 min）
從 100 uM working standard，以培養基配製 0、6.25、12.5、25、50、100 uM 標準品。使用未稀釋培養基作為 0 uM blank。每種標準品分注 100 uL 至 well，做重複或三重複。
☐ 加入樣品（5 min）
將每份無細胞上清液分注 100 uL 至 well，做重複或三重複。加入與樣品培養基相符的僅含培養基的 blank。
☐ 加入 sulfanilic acid 並進行重氮化（5 min）
將 50 uL 的 1% sulfanilic acid 加入所有 well（標準品與樣品）。輕輕混勻，於室溫反應 5 min，全程避光。
☐ 加入 NEDA 顯色（5 min）
將 50 uL 的 0.1% NEDA 加入所有 well。輕輕混勻，並在室溫下使粉紅色 azo dye 顯色（~5-10 min），全程避光。
☐ 測定吸光值（2 min）
使用 microplate reader 於 548 nm 測定 OD（可接受範圍 540-570 nm）；若設備支援，使用 570 nm 作為參考波長。 NEDA 加入後，在單一且短的時間範圍內讀取所有 well。
☐ 計算 nitrite 濃度（5 min）
從每個 well 的 OD 扣除 0 uM blank。以扣除 blank 後的 OD 對標準品 nitrite 濃度（uM）進行 linear regression；記錄 R2。以內插法計算每份樣品：C (uM) = (OD_sample - b) / m，其中 m 為標準曲線斜率，b 為截距。

Griess nitrite 定量分析（Griess nitrite assay；間接 nitric oxide 測定）

實驗材料

儀器設備