DPPH 自由基清除測定（DPPH Free Radical Scavenging Assay）

在 517 nm 測定穩定 DPPH radical 的還原（紫色 → 黃色），以量化抗氧化能力。提供 cuvette 與 microplate 兩種格式，並使用 Vitamin C 標準曲線。

biochemistry 入門 1 小時 9 步驟

階段 01 / 05準備

配製 DPPH working solution

DPPH 是帶未成對電子的穩定自由基，溶液呈紫色，在 517 nm 有強吸收。起始吸光值先校正到同一水準，各次實驗的清除率才能互相比較。

完成
STEP 1配製 DPPH working solution5 分鐘
將 DPPH 溶於 methanol，配製 stock。取 3 mL stock 轉移至 50 mL volumetric flask，以 methanol 定容。以 aluminum foil 包覆。
測定 working solution 在 517 nm 的吸光值，調整至 1.00 ± 0.200。
為什麼DPPH 對光敏感；控制起始 OD，才能讓不同實驗的清除率可比較。
注意操作 DPPH 時，須在弱光下進行或以 aluminum foil 遮光。

階段 02 / 05陽性對照

建立 Vitamin C 標準曲線

Vitamin C 是已知的強抗氧化劑。它作為陽性對照，用來確認試驗反應正常，並提供計算 IC₅₀ 的參考。

完成
STEP 2準備 Vitamin C 標準曲線10 分鐘
配製 Vitamin C 二倍序列稀釋，濃度依序為：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 µg/mL。
作為陽性對照以確認 assay 效能，並計算 IC₅₀。
為什麼標準曲線可確認 assay 呈線性反應，並提供計算 IC₅₀ 的參考。

階段 03 / 05混合

混合樣品與 DPPH

選擇 Cuvette 或 microplate 格式。Cuvette 適合少量樣品；microplate 可讓標準品、樣品與 blank 各做三重複。插圖示範 microplate 格式。

完成
STEP 3Cuvette 格式：混合 DPPH 與樣品2 分鐘
在 cuvette 中，將 3 mL DPPH working solution 加入 0.5 mL 樣品萃取液，輕輕倒轉混勻。
blank：以 0.5 mL solvent（methanol）取代樣品。
完成
STEP 6Microplate 格式：加入樣品至 well5 分鐘
將各樣品（或標準品／blank）100 µL 加入 flat-bottom 96-well plate 的各 well。每種濃度做三重複。
完成
STEP 7Microplate 格式：加入 DPPH 並混勻5 分鐘
使用 multichannel pipette 將 300 µL 的 0.4 mM DPPH 加入各 well。以輕柔軌道震盪混勻 10 秒。

階段 04 / 05反應

避光反應 30 分鐘

抗氧化物把氫原子交給 DPPH 自由基，使它還原成淡黃色的 DPPH-H。反應需要時間達到平衡；光會讓 DPPH 自行分解，造成清除率偏高。

完成
STEP 4Cuvette 格式：避光反應30 分鐘
將 cuvette 放在暗處（抽屜或以 aluminum foil 包覆的 rack），於室溫反應 30 分鐘。
完成
STEP 8Microplate 格式：反應並測定吸光值30 分鐘
避光反應 30 分鐘。使用 microplate reader 於 517 nm 測定吸光值。

階段 05 / 05判讀

測定 OD₅₁₇ 並計算 IC₅₀

測定 517 nm 的吸光值，將讀值換算為清除率，再繪製劑量反應曲線以估算 IC₅₀。

完成
STEP 5Cuvette 格式：測定 517 nm 吸光值2 分鐘
使用 UV-Vis spectrophotometer 測定 517 nm 吸光值（OD₅₁₇）。記錄樣品與 blank 的數值。
完成
STEP 9計算清除率
使用以下公式：
清除率 (%) = (1 − OD_sample / OD_blank) × 100%
繪製濃度與清除率的關係圖，以判定 IC₅₀（可清除 50% DPPH radicals 的濃度）。
為什麼IC₅₀ 是比較不同樣品與研究中抗氧化效力的標準指標。

DPPH 自由基清除測定（DPPH Free Radical Scavenging Assay）

biochemistry · 入門 · 1 小時

https://labgrimoire.com/zh/protocols/dpph-free-radical-scavenging-assay/

材料

☐ DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)（避光保存）
☐ Methanol（溶劑；可用 ethanol 取代）
☐ Vitamin C (ascorbic acid)（陽性對照）
☐ Sample extract：每次 reaction 使用 0.5 mL（cuvette 格式）或 100 µL（microplate 格式）
☐ Volumetric flask：50 mL
☐ Aluminum foil（用於遮光）

設備

☐ UV-Vis spectrophotometer（波長 517 nm）
☐ Microplate reader（517 nm；僅 microplate 格式使用）
☐ 96-well microplate（flat-bottom；僅 microplate 格式使用）
☐ Cuvettes（僅 cuvette 格式使用）
☐ Micropipettes（可調式，10–1000 µL）

步驟

☐ 配製 DPPH working solution（5 min）
將 DPPH 溶於 methanol，配製 stock。取 3 mL stock 轉移至 50 mL volumetric flask，以 methanol 定容。以 aluminum foil 包覆。
測定 working solution 在 517 nm 的吸光值，調整至 1.00 ± 0.200。
☐ 準備 Vitamin C 標準曲線（10 min）
配製 Vitamin C 二倍序列稀釋，濃度依序為：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 µg/mL。
作為陽性對照以確認 assay 效能，並計算 IC₅₀。
☐ Cuvette 格式：混合 DPPH 與樣品（2 min）
在 cuvette 中，將 3 mL DPPH working solution 加入 0.5 mL 樣品萃取液，輕輕倒轉混勻。
blank：以 0.5 mL solvent（methanol）取代樣品。
☐ Cuvette 格式：避光反應（30 min）
將 cuvette 放在暗處（抽屜或以 aluminum foil 包覆的 rack），於室溫反應 30 分鐘。
☐ Cuvette 格式：測定 517 nm 吸光值（2 min）
使用 UV-Vis spectrophotometer 測定 517 nm 吸光值（OD₅₁₇）。記錄樣品與 blank 的數值。
☐ Microplate 格式：加入樣品至 well（5 min）
將各樣品（或標準品／blank）100 µL 加入 flat-bottom 96-well plate 的各 well。每種濃度做三重複。
☐ Microplate 格式：加入 DPPH 並混勻（5 min）
使用 multichannel pipette 將 300 µL 的 0.4 mM DPPH 加入各 well。以輕柔軌道震盪混勻 10 秒。
☐ Microplate 格式：反應並測定吸光值（30 min）
避光反應 30 分鐘。使用 microplate reader 於 517 nm 測定吸光值。
☐ 計算清除率
使用以下公式：
清除率 (%) = (1 − OD_sample / OD_blank) × 100%
繪製濃度與清除率的關係圖，以判定 IC₅₀（可清除 50% DPPH radicals 的濃度）。

DPPH 自由基清除測定（DPPH Free Radical Scavenging Assay）

實驗材料

儀器設備