Alizarin Red S（ARS）染色透過 pH 依賴的螯合反應，辨識 formalin 固定、paraffin 包埋（FFPE）組織切片中的不溶性鈣沉積，並在鈣累積處形成橘紅色雙折射沉澱。本 protocol 使用單一格式：以 2% ARS 在 pH 4.1–4.3 染色 FFPE 組織切片，接續以 acetone 快速脫水並用 xylene 透明化。每次染色均須納入已知含鈣組織作為陽性對照。應用包括偵測 dystrophic calcification、metastatic calcification、calcium pyrophosphate dihydrate（CPPD）結晶沉積，以及評估病理樣本中的骨／軟骨礦化。
以兩槽新鮮 xylene 去除石蠟，再經 graded ethanol 與 distilled water 復水，使染液能進入切片。
將 slide 經過 2 槽新鮮 xylene，每槽 5 min。 依序經過梯度 ethanol：100%（2 min）→ 100%（2 min）→ 95%（2 min）→ 70%（2 min）。 以 distilled water 潤洗 2 min。 確認切片完全透明且無蠟狀混濁後再繼續。
為什麼完全去除 paraffin 並充分復水，水性 ARS 溶液才能進入組織。殘留 paraffin 會形成疏水屏障，阻止染料進入，並使鈣鈣化結節出現偽陰性結果。
注意去除石蠟不完全是造成偽陰性染色最常見的原因。不得縮短 xylene 浸泡時間。若 xylene 因溶解 paraffin 而明顯混濁，應更換。
將 Alizarin Red S 溶於 distilled water，每批調至 pH 4.1–4.3，並於使用前立即過濾。
將 2 g Alizarin Red S（C.I. 58005）溶於 100 mL distilled water；攪拌至完全溶解。 持續攪拌並逐滴加入 10% ammonium hydroxide，直到 pH 達 4.1–4.3；使用 pH meter 或 precision pH paper 確認。 使用前立即將溶液過濾至乾淨容器。 若配製後超過 1 小時，丟棄並重新配製新鮮溶液。
為什麼ARS–鈣螯合嚴格依賴 pH。只有在 pH 4.1–4.3 時，ARS 的 catechol 型螯合位點才會啟動 Ca²⁺ 配位。低於 pH 3.8 時，競爭性的二價陽離子會共同染色；高於 pH 4.4 時，與組織蛋白的靜電背景結合增加，降低專一性（Puchtler et al., 1969）。
注意每批均須確認 pH。不得假設不同批次的 pH 一致。過濾後仍可見沉澱的溶液已劣化，必須丟棄。
於 pH 4.1–4.3 下，ARS 與鈣螯合並原位形成不溶性橘紅沉澱。以 microscope 監看終點，並納入陽性與純水對照組。
將所有 slide 水平放置或置於 staining rack。 以新鮮過濾的 ARS working solution 完全覆蓋每個切片。 於室溫反應；反應 1 分鐘時取出一張測試 slide，以 light microscope 檢查。 持續染色，直到淡色至淺粉紅背景上的橘紅鈣化結節清晰可辨；總染色時間通常為 30 sec–5 min。 每次染色均納入陽性對照與未染色對照（僅用 distilled water）切片。
為什麼染色時間取決於組織與鈣濃度。鈣化明顯的樣本可能在 30–60 秒達到終點，鈣化較弱的樣本則可能需要最多 5 分鐘。定時以 microscope 監看，可避免染色不足（漏掉微弱沉積）或染色過度（瀰漫紅色背景遮蔽真實鈣化結節）。
注意不得在未以 microscope 確認前固定單一染色時間。若 5 分鐘時所有切片（包括陽性對照）均呈均勻淡色，working solution 的 pH 可能超出範圍。
不沖洗，先吸除 slide 邊緣液體，再快速依序通過 100% acetone、新鮮 acetone-xylene 1:1 混合液及 xylene。此序列可移除游離染料並保留不溶性鈣複合物。
一次從 ARS 溶液取出一張 slide。 以手腕快速甩動，甩除多餘溶液。 以吸水紙輕輕吸除每張 slide 的邊緣與背面；不得直接吸除或擦拭組織表面。 立即進行步驟 5；不得以水或 buffer 潤洗。
為什麼直接進入無水 acetone（步驟 5）可移除未結合的 ARS，同時保留不溶性 Ca²⁺–ARS 螯合物。此螯合物在 pH 4–9 的水性條件下穩定，因此 working solution 殘留的少量水分無害；但水性清洗步驟並非必要，只會延長處理時間而無益處。
在 fume hood 中，將 slide 浸入裝有 100% acetone 的 jar，快速沾浸 20 次（總計約 15–20 秒）。
為什麼快速以 acetone 脫水可移除組織水分，並清除切片背景中未結合的 ARS。Ca²⁺–ARS 螯合物不溶於 acetone，因此染色複合物會保留，同時多餘游離染料被洗去（Gregory et al., 2004）。
注意Acetone 高度易燃（閃點 −20°C）。僅能在 fume hood 中操作，並移除所有火源。不得以 ethanol 或 isopropanol 取代；這些極性質子溶劑在此步驟可能逐漸溶解 Ca²⁺–ARS 螯合物。
在 fume hood 中，將 slide 浸入裝有新鮮配製 Acetone-Xylene (1:1, v/v) 的 jar，快速沾浸 20 次（總計約 15–20 秒）。
為什麼acetone-xylene 混合液作為過渡透明化步驟，逐漸以非極性的 xylene 取代極性的 acetone。此步驟可避免從 acetone 直接轉入 xylene 所造成的組織混濁（乳白）。
注意使用前立即新鮮配製此混合液。室溫下 acetone 的揮發速度快於 xylene；存放中的混合液會提高 xylene 比例，降低透明化效率，並可能使組織混濁。
切片未乾前，立即加入可與 xylene 混溶的樹脂並覆上 coverslip。於 fume hood 平放至少 30 分鐘後，以 light microscopy 檢視橘紅沉積，並在 polarized light 下確認雙折射。
在 fume hood 中，將 slide 依序經過 2 槽新鮮 xylene，每槽 30 秒。 一次取出一張 slide，並立即在組織區域加入 1–2 滴 synthetic resin mounting medium。 以傾斜角度輕放 coverslip，減少氣泡；必要時輕壓。 檢查前，將 slide 在 fume hood 內平放至少 30 分鐘乾燥。
為什麼可與 xylene 混溶的 synthetic resin mounting medium 折射率接近玻璃（≈1.5），可改善影像品質，並保留 Ca²⁺–ARS 複合物的橘紅色與雙折射，使其可在室溫長期存檔。水性封片劑會隨時間溶解或破壞螯合物。
注意加入 mounting medium 前不得讓 slide 風乾；乾燥切片難以重新復水，且會降低封片劑附著力。從 xylene 轉入 mounting medium 時須連續完成。
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